klebsiella+sp.601细菌漆酶基因的克隆、蛋白表达纯化和酶学性质的研究

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1、摘要漆酶(EC1．10．3．2)是自然界广泛分布的多铜氧化酶家族中的一个成员，它能氧化一大类酚及非酚类化合物。漆酶广泛存在与植物、昆虫和真菌中，目前在细菌中也有发现。同植物及真菌漆酶比较，细菌漆酶可能比真菌漆酶有更多的优点，如不需糖基化、热力学稳定性好，酶活最适pH广泛等。本实验室己从土壤中筛选到的一株产漆酶菌Klebsiellasp．601，但产酶量较低，以致于不能直接从细菌细胞内分离纯化细菌漆酶，更无法全面了解该细菌漆菌的酶学牲质。为克服这一困难，本研究试图从glebsiellasp．601基因组中克隆出编码细菌漆酶的基因，在大肠杆菌表达系统中大量表达，分离纯化

2、获得纯酶并进行初步的酶学分析，为后续开发利用细菌漆酶，或运用蛋白质工程的方法对该酶进行改良提高它的酶活力或稳定性创建一个良好的平台。本实验利用Blast搜索GenBank上的肠杆菌科多铜氧化酶，寻找保守氨基酸序列，利用CODEHOP设计简并引物，以Klebsiellasp．601总DNA为模板进行PCR，扩增产物经测序与Blast分析，判定为部分漆酶基因片段。再通过Southern杂交的方法克隆出该菌编码漆酶的整个基因序列。通过Blast搜寻比对，克隆的基因编码的酶蛋白与大肠杆菌CueO具有很高的同源性．相似性达90％，相同性达78％。与EcoliCueO序列比较，

3、一个明显的不同是Klebsiellasp．601漆酶氨基酸序列在靠近C．端的部分即第400至420位氨基酸残基之

4、’日J多出20个氨基酸。通过亚克隆将克隆的细菌漆酶基因插入到细菌质粒表达载体pET23a上，转化到细菌宿主细胞BL21(DE3)plysS中进行表达。经一系列诱导表达条件摸索，使用0．7mmol／IIPl'G在37℃诱导4小时表达的效较佳。经Ni离子层析柱一步纯化，即可获得纯净的酶蛋白。从lL细菌培养物中可纯化出4．32mg酶蛋白。对该酶的酶学性质研究分析发现，Klebsiellasp．601细菌漆酶由536个氨基酸组成，分子量为58186．7道尔顿。p

5、l值为6．1。该蛋白富含丙氨酸(9．7％)、甘氨酸(10．3％)及亮氨酸(10．8％)。不稳定指数(II)为34．27，属稳定性蛋白之列。Kyte&Doolittle作图分析显示该蛋白的疏水性并不强，其疏水特性的总平均数(GRAVY)仅为一0．133。以DMP为底物时该酶的最适反应pH为8．0，以ABTS为底物时该酶的最适反应pH为3．0，以SGZ为底物时该酶的最适反应pH为7．0，较佳的反应温度为37℃。Klebsiellasp．601细菌漆酶在pH7．0时稳定性最好，在pH3-4强酸性条件下处理5小时仍能保持保持70％以上的相对酶活，在pill0．0强碱性条件下

6、处理3小时左右仍具有50％多的相对酶活。利用Lincwcavcr-Burk双倒数法作图，求得Klebsiellasp．601细菌漆酶在pH8．0、37℃条件下催化DMP氧化反应的K。值为0．49mmol／L，l【cat值为1。07x103S-Is～，l【ca以h值为2．18x103mMdsl；在pH3．o，37。C条件下催化ABTS氧化的K。值为7．63mmol／L，knt值为7．85xl3s-1，l(ca,／Km值为1．03x103mM。1s．1；在pH7．0，37"C条件下催化SGZ氧化的K。值为2．29x10。retool／L,km值为1．08xloas～，l

7、(cadgm值为4．71x105mM。s_1。由l(cadCm值可见，Klebsiellasp．601细菌漆酶在pH7．0，37"C条件下催化SGZ氧化比在适宜条件下催化DMP和ABTS氧化反应更有效。关键词：妣据肋够601细菌漆酶，基因克隆，蛋白表达与纯化，酶动力学ABSTRACTLaccuse(ECL10．3．筋isamemberofthemuticopperoxidascswhichwidelyexistinnature，andcatalyzestheoxidizingreactionofacategoryofphenolandnon-phenoliccomp

8、ounds．Inthepast，laccasesweremainlyfoundinplants，insectsandfungi．However，laccasesarealsofoundrecentlyinprokaryoticbacteria．Bacteriallaccasesmayperhapsdisplaydifferentenzymepropertiesandkineticsascomparedwiththoseoffungiwhicharewidelyusedinindustry．Forinstance，theglycosylationmodificat