类球红细菌自诱导物合成酶基因的克隆、表达与其蛋白性质的研究

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1、西南大学硕士学位论文摘要类球红细菌自诱导物合成酶基因的克隆、表达及其蛋白性质的研究微生物与生化药学专业硕士研究生：苗艳指导老师：叶姜瑜副教授摘要细菌通过产生信号分子来感知环境中自身与其他细菌的数量。当信号分子浓度随细菌密度的增加达到一定阀值时，整个细菌群落就会在群体水平上作出基因表达的调整，从而使细菌作出适应环境的变化，这一系统被称为群体感应(Quorum．sensing，QS)系统。类球红细菌是光合细菌的主要成员之一，属于革兰氏阴性菌，能在多种环境下生存，在光照厌氧异养条件下可产氢。该菌的饼群体感应系统产生的自诱导物为酰

2、基高丝氨酸内酯(7，8一cis-N-(tetradeeenoyl)homoserinelactone)。本文根据GenBank登录的Rhodobactersphaeroides2．4．．『cerl编码序列(GenelD：3719690)设计一对特异性的引物，以R．印基因组为模板，熟启动PCR方法扩增cerI的编码序列，将扩增的片段克隆至原核表达载体大肠杆菌DH5apET28a(+)；通过菌落PCR、酶切重组质粒和测序鉴定重组质粒。PCR产物纯化后，将鉴定正确的重组质粒pET28a(十)．cerl转化大肠杆菌BL21(DE3

3、)进行诱导表达，SDS．PAGE检测。利用DNASTAR、VectorNTI9．0、Signal、Jpred等生物信息学平台对类球红细菌自诱导物合成酶进行了一级结构、功能域、信号肽、跨膜结构、二级结构等进行了分析。在数据库(http：／／www．ExPaSv．or#)上搜索氨基酸序列同源性大于30％的蛋白晶体结构，确定三级结构模板，对目的蛋白的三级结构同源建模。通过SWISS．MODEL建模网站搜索到的铜绿假单胞菌自诱导物合成酶的晶体结构作为最佳模板，模建类球红细菌CerI的三维结构。类球红细菌自诱导物合成酶蛋白CerI的

4、一级结构分析结果如下：CerI序列中含有1个自诱导物合成酶标志，3个酪蛋白激酶II磷酸化位点，1个蛋白激酶磷酸化位点，3个豆蔻酰化位点。该蛋白不存在信号肽，不是分泌蛋白。对Ceil的二级结构预测结果表明cerI蛋白既有a螺旋存在也有B折叠存在，a螺旋位置主要在第7""26，129"--139，175～183等区段，p折叠位置主要在第65"'76，145,---158，195'--,209等氨基酸区段。通过对CerI西南大学硕士学位论文摘要蛋白三级结构同源建模发现，类球红细菌的CerI与铜绿假单孢菌的LasI的空间结构相似，

5、它们属于同一个折叠类型。通过在类球红细菌中加入经IPTG诱导的重组蛋白菌液混合打孔培养，研究了自诱导物合成酶对类球红细菌培养的影响，结果表明该蛋白可以促进对数期细菌的趋散生长，同属细菌的上清液做为培养液进行添加时，细菌的生长受到抑制。在对数期类球红细菌中加入经IPTG。诱导的重组蛋白菌液进行混合培养，通过检测样品产氢量和P船积累量发现：结果与同课题组成员在对数期加入信号分子浓缩提取液后产氢量和PHB积累量的试验结果趋势相同。关键词：类球红细菌群体感应系统自诱导物合成酶克隆表达产氢西南大学硕士学位论文AbstractClon

6、ing，expressionandcharacterizationofthegeneencodingautoinducersyntheticasegenecerIinRhodobactersphaeroidesMajor：Microbiology&BiochemicalPharmacyDirection：MicrobialfunctionalGenomics＆DrugScreeningSupervisor：AssociateProfessorYeJiangyuMasterCandidate：MiaoYanABSTRACTM

7、anyspeciesofbacteriaexhibitquorumsensing(QS)，theabilitytoreleaseandrespondtosignalmolecules．Typically，cellsproduceallextracellularautoinducermoleculeoftenapeptide(inGram+species)orallacylhomoserinelaetone(inGram'strains)，oncetheconcentrationexceedsathreshold，thece

8、llisinducedtoundertakesomeaction，forexample，expressinggenesleadingtotheexcretionofspecificenzymes，toxins，orotherfunctionalproducts．Ⅲstypeofregulationhas