基因克隆及蛋白表达

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1、基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室李　丰研究某一目的基因功能一般策略目的DNA获得来自三条途径:1.genome上的特定区域或序列2.含有目的DNA的质粒3.从cDNA文库中扩增单个已知cDNA获得目的DNA构建含目的DNA质粒转化细菌蛋白表达纯化转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化第一部分PCR聚合酶链反应（PCR）技术聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片断的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。P

2、CR技术具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。一、PCR实验原理一、PCR实验原理二、PCR的反应体系1.PCR引物（1）primer长度：18-30bp引物短特异性降低引物长影响产物生成（2）primer浓度：0.1-1.0umol/L浓度过高错配、引物二聚体增加浓度过低PCR效率降低二、PCR的反应体系2.缓冲液KCl、Tris-Cl、MgCl2，Mg2+：1.5～2.0mMMg2+:DNA聚合酶活性PCR产量Mg2+:PCR反应特异性二、PCR的反应体系3.DNA聚合酶TaqDNA聚合酶LADNA聚合酶PrimeSTAR(P

3、yrobestDNA聚合酶)PfuDNA聚合酶TaqDNApolymerase5‘5‘3‘3‘5‘3‘3‘5‘5’3’DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的条件下，以dNTP作为底物，沿5’3’方向合成与模板互补的DNALATaqDNAPolymerase1.5’3’DNA聚合酶活性；2.3’5’DNA外切酶活性。Pyrobest&pfuDNAPolymeraseTaqDNA聚合酶活性3’5’外切酶活性，可信度极高PCR产物为平滑末端PCR的反应体系4．dNTP:50-200umol/L5.模板DNA（1）单链DNA（2）双链DNA（3）浓度：基因组DNA：1ug质粒D

4、NA：10ng三、基本操作步骤1.变性(denature):95℃高温下,双螺旋氢键断裂,双链DNA解链成为单链DNA2.退火(annealing):两条引物与模板DNA扩增区域的两端按碱基互补配对结合.3.延伸(extension):在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下,TaqDNA聚合酶在72℃下,将单核苷酸按碱基互补配对原则从引物3‘端掺入,,使引物沿5’→3’方向延伸合成新股DNA四、条件优化1.变性:95℃变性20-30s,即可使各种DNA完全变性。2.退火:引物与模板退火温度由引物长度和GC%决定,退火温度一般应比Tm值低4-12℃为宜,退火时间一般为20-40s

5、。3.延伸:通常68-75℃。延伸时间取决于扩增片断的长度.可以500bp/30s为基准，根据目的片断的长度计算反应时间。4.循环次数：一般为25-35次。PCR反应液PCRBuffer（Mg2+）2.5μldNTP混合物（各2.5mM）4μl模板DNA1μl引物1（20uM）0.5μl引物2（20uM）0.5μlTaqDNApolymerase（5U/ul）0.25μlddH2O至25μlPCR反应条件94℃5min94℃30sec55℃30sec30Cycles72℃1min72℃10min4℃forever五、PCR引物的设计PCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物PC

6、R引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个目标上取得平衡.可以利用计算机软件进行引物设计,引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡,找出最佳引物.有时也需根据实验的具体要求进行适当调整.引物设计的基本原则(一)引物长度在16-30bp范围内,以18-24bp为最佳.引物过短,产物特异性降低,每增加一个核苷酸,引物特异性可增加4倍.引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分,不包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列.引物设计的基本原则(二)引物末端1.引物的3’末端对于PCR反应是关键.2.引物的3’末端的第一和第二个碱基影响TaqDNA聚合酶的延伸效率,故其

7、影响PCR反应的扩增效率及特异性.引物3’末端最佳碱基选择G或C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。引物设计的基本原则3.引物5’末端的碱基无严格限制当引物的长度足够时,引物5’末端的碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态。可在5’端加上限制内切酶位点,启动子序列或其他序列等,以便于PCR产物的分析克隆。引物设计的基本原则4.在一个PCR反应中的一对引物之间不应存在互补序列,特别是3’末端应尽量避免互补,以免形成“引物二聚体”造成引物浪费和非特异性的扩增.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级结构