青稞查尔酮合酶基因的克隆与原核表达

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1、，■？—？，分类号Ｓ５口．３０７３学号Ｓ２０１２１１０３西川巧化大学顾壬学位论文青裸查尔剛合酶基因的克隆与原核表达方建抱専教师巧宗５教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向植物分子生物学２０１５年５月ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎａｎｄＰｒｏｋａｒｏｔｉｃＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｙｐＣｈａｌｃｏｎｅＳｎｔｈａｓｅＧｅｎｅｈｉｉｎｅＨｕ

2、ｌｌｅｓｓ巧ａｒｌｅｙＱｇｋ（ｙ）ＢｙＪｉａｎＦａｎｇＡｄｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｏｎｇｙｕｎＦｅｎｇＭａｊｏｒ：ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＤｉｒｅｃｔｉｏｎ：ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｙ，２０１５论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含

3、为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同王作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。■口５研究生签名：表又／年月＇ｙ曰关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅，，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。

4、□本论文保密。，在＿年解密后适用本授权＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）一＾／娘１＞兰研究生签名；乃户年。居月日导师签名：可＾月／ＪＴ日＾台摘要青裸（材ｏＷｅｗ／ｗＶＭ如ｗｅＬ．ｖａｒ．Ｈｏｏｋ．巧是我国青藏高原地区对多棱裸粒大麦＂＂的统称，即裸大麦。青裸不仅属于Ｈ高两低（高蛋白、高纤维、高维生素、低脂肪和低糖－Ｂ）食品，更含有丰富的功能活性成分如黄爾类化合物、Ｙ氨基下酸、多酷类化合物、－葡聚糖等这些营养物质对人的身体具有保健作用族维生素Ｗ及Ｐ，。随着人民生活水平的提高，青裸的营养价

5、值亦受到更加重视。一黄丽是植物中、清除自由基、类重要的次生代谢产物，具有抗氧化、提高免疫力防止骨质疏松、保护肝脏等药理作用，是人们的理想保健物质。黄爾在植物中主要有黄丽、黄爾醇、黄搞丽、异黄厕等十几类青裸中主要Ｗ黄厕醇为主。查尔爾合酶（Ｃ试Ｓ）为黄丽，一个关键限速酶代谢途径的第，广泛分布在植物界，并且在植物的生长和适应环境活动中一起着重要作用。，近年来也成为分子生物学及植物生理学的研究热点之＂＂－９４－为了了解黄丽代谢途径中相关酶基因的作用本实验Ｗ青裸１９１为材料巧用同，源克隆的方式，克隆出

6、了青裸查尔丽合酶基因的编码序列（Ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ）全长，－３２ａ－并构建载体ｐＥＴ／／ｖＣ／玲进行原核表达得到了其融合蛋白。本实验主要结果如下；１．采用同源克隆的方法获得了青裸Ｃ端的ＣＤＳ全长序列，全长为１３５１ｂｐ，该序列包一含个完整的开放閒读框（〇ＲＦ）ｎ９７ｂｐ，该ＯＲＦ编码３％个氨基酸。序列分析表明：４３４ＫＤａ５说该基因编码蛋白分子量．等电点为预测等电点（ＰＩ伪是酸性蛋白巧酶蛋白，，的不稳定系数（巧为４０．１０（大于４０），属于不稳定蛋白，预测其半衰期为３０

7、ｈ，平均亲水指－０数为．０９０是亲水性蛋白。，２．Ｂｉａｓ也对比分析结果表明：该全长序列与大麦同源性最高，达到９９％，与普通小麦同源性为９１％；与水稻同源性为８８％。与玉米同源性为８５％；与高梁同源性为７８％；５％－７４％之间与荀萄、矮牵牛、橄揽、马铃著、西红柿等已知的Ｃ占Ｓ基因的同源性在６。进一步构建系统进化树显示青棵与单子叶植物的大麦、普通小麦的亲缘关系最近相对双，子叶植物如西红柿等关系较远。３．使用在线服务器ＰＨＹＲＥ２Ｓｅｒｖｅｒ结合ＳＯＰＭＡ软件对ＨｖＣＨＳ酶蛋白的二级结构－

8、４１％、％－进行预测发现ＨｖＣＨＳ酶蛋白的二级结构主要由ａ螺旋（无规则卷曲（１２、及））ＰＩ５％组成－Ｎ－却具丰转角０）。进行蛋白质的Ｎ糖基化和憐酸化预测，没有发现糖基化位点，富的磯酸化位点声个丝氨酸（Ｓｅｒ）、６个苏氨酸（Ｔｈｒ）和２个酪氨酸（Ｔｙｒ）存在磯酸化活性位点。４－．将青棵Ｃ／拟基因的编码序列与表达