青稞类黄酮o-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

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1、Ｉ？’．．分类号Ｓ５１１３０７５学号Ｓ２０１２１１１６■四‘ｊｌｌ巧业大学顾壬学位论文■’．．、青穗类黄狮０－甲基转移酶基因的克隆及＾原核表达分祈＊、．．张驗飞．、指导教师冯宗云巧巧学科专业生物化学与分子生物学－：研究方向植物分子生物学？＼２０１５年５月．＇．？？？？．．．一■■．．？＇■＇＾，．、－■．－．‘：＇，－．．．，Ｉ？－．Ｉ＃．．．．．‘、ｒ．八．ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ

2、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦ－ｌａｖｏ凸ｏｉｄｓＯｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＧｅｎｅｉｎＱｉｎｇｋｅ巧山ｌｅｓｓＢａｒｉ巧）ＢｙＫｕｎｆｅｉＺｈａｎｇＡｄｖｉｓｏｒ．：ＰｒｏｆＺｏｎｇｙｕｎＦｅｎｇＭａｏｒ：ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｊｙｇｙＤｉｒｅｃｔｉｏｎ：ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａ２０１５ｙ，论文独创性声明本人郑重声明

3、；所呈交的学位论文是我个人在导师Ｉｔ导下进行研究工作所取得的成果，，。尽我所知除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学一或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借、阅，可Ｗ采巧影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农

4、业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在。＿＿年解密后适用本授权＂＂（请在Ｗ上□内划Ｖ）一＾仁广日研究生签名：梦备召年月＾导师签名：７参勺厂年／月／厂日方＞／四川农业大学硕ｄｒ学位论文摘要青裸（好ｏｒ旅ＷＷＶＭ如！ｒｅＬ．ＷＫＨｏｏｋ．Ｆ．）具有独特的营养物质和医疗保健、成分，能够有效改善和均衡人体营养，预防结肠癌糖尿病、也血管疾病等多种疾病，＂一＂一且生长环境特沫，被人们誉为高原空。植物中的甲氧基类黄爾是类重要的次生代谢产物，可改善类黄爾的溶解性，増强代谢稳定性和降

5、低毒副作用。同时，具有抗菌抗癌抗肥胖的作用。。因此，富含甲氧基类黃酣的绿色食品越来越受到人们的关注但是甲氧基类黄丽在谷物中含量偏低－，且对类黄丽０甲基转移酶的酶促反应机理尚＂＂－－１未明确，限制了其广泛的应用。本研究Ｗ具有较髙黄爾含量的青裸品系９４１９０－－ＯＭｒ７为研究材料，克隆得到了青裸类黄丽甲基转移酶（好Ｖ饼：）基因，并将其转一入大肠杆菌中进行原核表达，纯化重组蛋白，Ｗ期为下步进行酶功能验证和催化机理的研究提供依据，为深入挖掘青裸的医疗保健功能和培育富含高功能成份的青裸品种奠定基础。得到的主要结果如下：－１．本试验采用同源克隆方法得到好Ｖ饼：ＯＭ７

6、７基因的ＯＲＦ序列，全长１０７１ｂｐ，编码３５６个氨基酸，蛋白质的分子式为Ｃ１７２９Ｈ２７００Ｎ４４８Ｏ５０６Ｓ２１，预测蛋白分子量为３８．６５ＫＤａｉ５－．巧。基因序列包含５，ｐ为，属于酸性蛋白质个植物０甲基转移酶保守序列，其中保守区Ｉ和ＩＩ的序列完全保守、ＩＶ、Ｖ与其共有序列相比存在差异。，保守区田－ＢＬＡＳＴ比对ＯＭＴＮＣＢＩ结果显示该蛋白酶属于ｓ。ＩＩ类类黃丽２－．根甲基转移酶氨基酸序列构建了ＮＪ系统进化树据植物类黄丽０，该进化树聚一一。为两类，其中１６种双子叶植物亲缘关系较近聚为类，１５种单子叶植物聚为类－ＯＭＴ青裸ＨｖＱＫｌ与大麦ＨｖＯＭＴｌ

7、亲缘性最化同时与普通小麦、玉米、黑麦草、－野生稻、节节麦等禾本科单子叶植物中的类黄爾０甲基转移酶亲缘关系较近，而与－甘廉、芒草、玉米等较远。可Ｗ看出，青裸、大麦、普通小麦及节节麦类黄爾０甲－甲基转移酶有很高的亲缘性基转移酶在进化上与咖啡酸０。－－合蛋白最佳表达条件为３．构建ＨｖＱＫＯＭＴｌ；终浓ｐＥＴ重组质粒，融°度在巧Ｃ诱导８ｈ，效果最佳，融合表达蛋白约５８ＫＤａ。－４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对ＮＮＴＡＨｖＱＫ－ＯＭＴｌｉ