百合aco基因的克隆及原核表达分析

《百合aco基因的克隆及原核表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、2百合ACC氧化酶基因的克隆及原核表达分析中所受的影响，首次将百合归为不敏感或较敏感【6】。Elgar等r7】在研究东方百合、亚洲百合对乙烯敏感度时也提出了类似的观点。他们认为在切花瓶插过程中，产生的乙烯非常少或几乎无法检测出来，并且只有当花瓣萎蔫时才能发现乙烯的存在。但是大多数研究表明，乙烯会缩短百合切花的寿命【8-9l。乙烯对切花的作用与结合组织部位有关、与组织敏感性有关【l们，不同的敏感性还与组织将乙烯氧化为有活性的代谢物的能力，以及催化这些反应的酶【111。根据开花衰老过程中花卉乙烯的大量生成与否，可将花卉划分为跃变型和非跃变型两大类【121。百合切花花朵乙烯释放

2、量属于哪种类型，迄今仍未明确。有人研究百合花朵的不同发育期与乙烯释放量、呼吸强度变化情况，发现百合花朵的乙烯释放量和呼吸强度变化趋势基本一致，属于乙烯末期上升型花卉【13】。杨秋生等【9】研究认为常温下亚洲杂种百合Gencve切花内源乙烯释放量的变化与跃变型果实晚熟过程类似：低温下内源乙烯释放量始终未出现明显的高峰，这说明乙烯不是衰老的启动因子，而只在一定程度上加快衰老的进程。研究证明，部分乙烯释放型百合花卉，花朵开放时，伴随着乙烯释放而衰老。乙烯是其内源的衰老激素，花瓣衰老的最初反应之一便是自动催化而产生乙烯，一方面衰老过程中产生乙烯，另一方面是产生的乙烯又激活与衰老有

3、关基因的表达进一步促进衰老，并导致花朵最终凋谢变质。百合花的衰老受乙烯的诱导，主要是由于乙烯能诱导花瓣半胱氨酸蛋白酶的表达，该酶对膜脂的脱脂作用使得膜的完整性发生变化，从而启动其花瓣的衰老。因此控制百合切花乙烯的生物合成，是延缓切花的衰老、延长其保鲜期的一条主要途径。1．2ACC氧化酶(ACO)基因的研究进展1．2．1ACO基因克隆的研究进展ACO是乙烯合成途径中的最后一个酶，此酶最早被№g及其同事定名为乙烯形成酶，直到90年代初，这个酶的反应特征才被阐明。由于ACO需要抗坏血酸和氧作为辅助底物，且需要Fc2+和C02作为辅助因子，因此把EFE称为ACC氧化酶更合适。AC

4、O的鉴定远比Acs困难的多，因为不能用通常的生物化学方法分离出细胞提取液中的ACO；但是，采用分子克隆的办法来鉴定ACO，可以克服直接从植物组织中提取Aco的困难，这使ACO的研究柳暗花明。虽然不能用传统的生化方法分离出这个酶，但是可以鉴定与成熟有关的cDNA的功能性表达。Gderson等(1985)从不同成熟阶段的番茄中分离了AcO的mI斟A，并使其在兔网状细胞裂解液系统中翻译。用SDS．PAGE分析翻译产物，他们发现有4．8个翻译产物的水平在成熟过程中提高，其中一个是PG，而其他的功能未知【14】。S1ater等提取了成熟时的番茄p01y(A)+对叮A，建立了cDNA

5、文库【15】。用绿熟期和完全成熟期番茄果实的cDNA作为探针进行差异杂交筛选，用此方法鉴定与成熟有关的cDNA克隆，其中有6个克隆编码的多肽，其分子量与例erS0n体外翻译的结果研究一致。将其中一条编码35kDa蛋白第一章文献综述3的克隆命名为pTOMl3，在番茄成熟过程中的绿熟期果实及叶受伤后，编码35kDa的蛋白质的m砌妊的出现与乙烯的合成量相一致。用pToMl3作为探针在成熟、损伤及未成熟的果实及受伤的叶片的对蛆中筛选出的mRNA，体外翻译时同样产生35kDa的蛋白，但在未受伤的果和叶中，却未得到相应的蛋白。于是Smitll等提出，pToMl3可能是一个与乙烯生物合

6、成有关的酶。‰g等最初试图在酵母中表达pTOMl3，但未成功，因为pTOMl3插入片段的5’端缺少了2个碱基，故mIⅢA不能翻译，经过修正的cDNA克隆导入酵母，成功表达了ACO的活性，从而证实pTOMl3翻译的产物是ACO。表1．1从植物中已克隆到的ACO部分基因1'able1—1ACOg∞e舶mdi侬氍ntpl姐t除了番茄外，也相继从其他多种植物中克隆了ACO基因(表1．1)，还有黄杉【16】、康乃馨【171、甘蔗【1引、仙人掌【191、哈密瓜【201、白兰瓜【211等。1．2．2ACO基因表达的研究进展1．2．2．1Aco基因表达的诱导因子植物ACO基因的表达受激素

7、、环境协迫、植物的生育过程等诱导。乙烯处理诱导了拟南芥、蝴蝶兰、网纹甜瓜、碧冬茄、青花菜等ACO基因的表达；ABA则诱导青花4百合ACC氧化酶基因的克隆及原核表达分析菜ACOXl和ACO)(2的表达【列。NaCl处理能诱导蝴蝶兰AC01的表达；而L～A可诱导黄瓜ACO基因的表达。最近的研究表明，LAA能诱导乙烯的增加主要是通过乙烯自身诱导了AcO基因的转录口3J；同时ACO基因对机械伤害、泽水、臭氧、病原体侵染、光温、干旱等环境协迫有应答。如伤刺激诱导花椰菜ACCOXl和ACCo)(2、番茄Ac01、网纹甜瓜ACol、桃ACO