草鱼NKlysin基因的克隆、原核表达与活性分析

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1、第41卷第10期水产学报Vol.41,No.102017年10月JOURNALOFFISHERIESOFCHINAOct.,2017文章编号:1000-0615(2017)10-1500-12DOI:10.11964/jfc.20160910553草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析王改玲*，王明成，李传凤，潘磊，刘盼婷(黄淮学院生物与食品工程学院，河南驻马店463000)摘要：为研究草鱼抗菌肽NK-lysin基因的组成结构、在组织中的表达差异及其抑菌活性，实验根据已知鱼类NK-lysin基因保守

2、区序列设计上下游引物，采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆草鱼NK-lysin基因(Cinkl)，RT-PCR进行各组织间的表达分析，并构建Cinkl成熟肽的原核表达载体，采用琼脂糖孔穴扩散法检测重组蛋白的抑菌活性。结果显示，CinklcDNA全长768bp，编码121个氨基酸；基因组DNA全长3361bp，包含4个外显子和3个内含子。经多序列比对分析和结构域预测表明，CiNkl氨基酸序列具有SAPLIP家族的特征：含有6个保守的半胱氨酸和saposinB蛋白结构域，与斑马鱼Nklc、Nkld的相似性分别

3、为57.98%和63.03%。构建NK-lysin氨基酸序列系统进化树，发现CiNkl与斑马鱼Nklc、Nkld聚为一支。RT-PCR检测结果显示，CinklmRNA在所有检测的草鱼组织中均有表达，在脾脏中表达量最高，心脏、鳃、中肾和头肾的表达量次之，皮肤、脑、肝脏和肠有微量表达。pET-28b-MBP与CiNkl成熟肽序列构建的原核表达质粒在宿主菌Rosetta(DE3)表达出约57ku的可溶性融合蛋白，利用Ni-NTAHis·Bind树脂进行纯化，CiNkl重组蛋白对G–细菌如大肠杆菌M15株、嗜水气单胞菌

4、，以及G+细菌如金黄色葡萄球菌均具有抑菌活性。基于草鱼NK-lysin的组织表达特征和重组蛋白的抑菌活性，推测NK-lysin在草鱼的先天性免疫防御中发挥调节作用。关键词:草鱼；NK-lysin；基因克隆；组织表达；抑菌活性中图分类号:Q786；S917.4文献标志码:A抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)是一类水产动物(鱼类、虾和蟹)的免疫力和抗病力[3-5]。对细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫和肿瘤细NK-lysin是机体自然杀伤(naturalkiller,NK)胞等具有杀伤作用的

5、小分子多肽(12~50个氨基细胞和细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocytes,酸)，是生物体先天性免疫防御系统的重要组成CTLs)中存在的一种被称为“颗粒溶素”(granulysin)部分。抗菌肽具有抗菌谱广、生化性质稳定、的抗菌肽，与人颗粒溶素属于直系同源基因。毒副作用低、不易产生耐药性等诸多优点，一NK-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(saposin-like直被人们认为是抗生素的理想替代品[1]。迄今为protein,SAPLIP)家族的成员，具有鞘脂激活蛋白止，人们在细菌、真菌、植物、无

6、脊椎动物以B(saposinB)结构域和6个保守的半胱氨酸，且富及脊椎动物中已发现的抗菌肽种类超过2000种，含带正电荷的氨基酸[6]。NK-lysin具有与膜结合其中已被鉴定的水产动物抗菌肽种类包括的能力，并能够改变细胞膜的完整性，能够杀hepcidin、defensin、pleurocidin、piscidin、灭细菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞等[7-9]。moronecidin、misgurain、parasin、LEAP-2和自最早的人类granulysin[10]和猪NK-lysin[11]发NK-ly

7、sin等[2]。抗菌肽在水产养殖中的应用研究现以来，人们相继在牛(Bostaurus)[12]、马(Equus已取得一定成效，通过在饲料中添加抗菌肽，可提高caballus)[13]、水牛(Bubalusbubalis)[14]、鸡(Gallus收稿日期：2016-09-23修回日期：2016-11-30资助项目：国家自然科学基金(31402334)；河南省基础与前沿技术研究计划(142300410111)通信作者：王改玲，E-mail：wgl939@126.comhttp://www.scxuebao.cn1

8、0期王改玲，等：草鱼NK-lysin基因的克隆、原核表达与活性分析1501gallus)[15]、斑点叉尾鲖(Ictaluruspunctatus)[16-17]、1/3。驯养结束后，挑选平均体质量约为115g的牙鲆(Paralichthysolivaceus)[18]、半滑舌鳎(Cynog-草鱼3尾，用于提取草鱼各组织总RNA。lossussemilaevis)[8]、斑马鱼(Dan