家兔prrx基因家族克隆分析、原核表达及表达图谱

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1、硕士学位论文题目家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达及表达图谱作者陈瑞完成日期2015年3月学科门类农学专业临床兽医学研究方向小动物疾病指导教师杨晓农教授学院（系、部）生命科学与技术学院授予学位日期年月日PrrxGeneFamilyofOryctolagusCuniculus:cloning,ProkaryoticExpressionandExpressionPatternByChenRuiAThesisSubmittedToSouthwestUniversityforNationalitiesinFul

2、fillmentoftheRequirementsForMasterDegreeSupervisorbyProfessorYangXiao-nongCollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalitiesChengdu,610041,P.R.ChinaMarch2015基金项目西南民族大学研究生创新型科研项目资助（批准号:CX2014SZ99）摘要Prrx1（MHox、k2、Pmx、Prx1）、Prrx2（S8、Prx2）和Pr

3、rx3（Prx3、SHOX2、SHOT、OG12）是高度保守的同源异型框基因转录因子。Prrx1缺乏鼠有腭裂，脊柱骨骼缺陷和四肢、颌骨、桡尺骨和胫腓骨轻微的组织发育不良。Prrx2缺乏小鼠基本无形态学变化，但有轻微的心肌功能异常。Prrx1和Prrx2都缺的表现型显示它们在脊柱、舌骨弓、颅面、大动脉弓、垂体和肢体发育都有重要影响。即使是在截肢的情况下，一些两栖类动物的受损部位可以再生，而且没有瘢痕。这种完美的愈合过程涉及Prrx1基因，但对于哺乳动物，在胚胎无瘢痕伤口愈合中起重要作用的是Prrx2基因。Prr

4、x3基因表达于胚胎期的中胚层和外胚层，与骨和软骨的形成、大脑、脊髓、神经、心脏、颅面部和近端肢体的发育有关。Prrx3基因的甲基化与肺癌具有密切关系，可能成为肺癌的早期筛查指标。本研究旨在研究家兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的结构，表达图谱和在不同时期各组织的动态变化，为Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的进一步的研究和应用提供参考。本研究主要获得以下成果：1.本研究首次克隆得到新西兰白兔Prrx1a（登录号：KP726284）、Prrx1b（登录号：KM222500.1）、Prrx2和Prrx

5、3（登录号：KP726285）基因，并对其DNA序列和氨基酸序列进行生物信息学的分析，预测其可能的生物活性、结构及功能。2.本研究分别构建了pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3四种原核表达载体，转化进入BL21感受态细胞。用IPTG进行诱导表达，优化IPTG诱导浓度、时间、温度。超声破碎，HistrapTMHP纯化柱进行纯化，并用Westernblot证实了融合蛋白的抗原性良好，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。3.本研究首次对新西兰白兔的常用的六个内参基因GAPDH、HPR

6、T1、18SrRNA、B2M、Sdha、β-actin的表达稳定性进行比较。证实新西兰白兔不同的发育时期和组织中，最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时，可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-PCR数据的指标，以确保试验组个体间的差异最小，和小变量的准确数据分析。4.本研究首次用RT-PCR的方法确定不同发育阶段各器官中新西兰白兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因mRNA的表达量。并比较了部分器官中Prrx1的两种变异剪切体Prrx1a和Prrx1b的表达

7、量差异。I5.用免疫组化的方法证实Prrx家族蛋白在新西兰白兔各器官的表达。由于转录后调控，mRNA的表达量与蛋白在各器官的表达量并不完全相同。然而，由于缺乏有效的单克隆抗体，不能有效区别几种蛋白。关键词：新西兰白兔；成对相关同源异型框基因（Prrx）；克隆；生物信息学分析；融合蛋白表达；Westernblot分析；表达图谱；内参基因筛选IIPrrxGeneFamilyofOryctolagusCuniculus:cloning,prokaryoticexpressionandExpressionPatter

8、nGraguateStudent：ChenRuiDirector：YangXiao-nongAbstractPrrx1(MHox,k2,Pmx,Prrx1),Prrx2(S8,Prx2)andPrrx3（Prx3,SHOX2,SHOT，OG12）arebelongtohighlyconservativeHomeoboxgenefamily.ThePrrx1nullmicehaveacleftpala