《家兔prrx基因家族克隆分析、原核表达及表达图谱》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
硕士学位论文题目家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达及表达图谱作者陈瑞完成日期2015年3月学科门类农学专业临床兽医学研究方向小动物疾病指导教师杨晓农教授学院（系、部）生命科学与技术学院授予学位日期年月日 PrrxGeneFamilyofOryctolagusCuniculus:cloning,ProkaryoticExpressionandExpressionPatternByChenRuiAThesisSubmittedToSouthwestUniversityforNationalitiesinFulfillmentoftheRequirementsForMasterDegreeSupervisorbyProfessorYangXiao-nongCollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalitiesChengdu,610041,P.R.ChinaMarch2015 基金项目西南民族大学研究生创新型科研项目资助（批准号:CX2014SZ99） 摘要Prrx1（MHox、k2、Pmx、Prx1）、Prrx2（S8、Prx2）和Prrx3（Prx3、SHOX2、SHOT、OG12）是高度保守的同源异型框基因转录因子。Prrx1缺乏鼠有腭裂，脊柱骨骼缺陷和四肢、颌骨、桡尺骨和胫腓骨轻微的组织发育不良。Prrx2缺乏小鼠基本无形态学变化，但有轻微的心肌功能异常。Prrx1和Prrx2都缺的表现型显示它们在脊柱、舌骨弓、颅面、大动脉弓、垂体和肢体发育都有重要影响。即使是在截肢的情况下，一些两栖类动物的受损部位可以再生，而且没有瘢痕。这种完美的愈合过程涉及Prrx1基因，但对于哺乳动物，在胚胎无瘢痕伤口愈合中起重要作用的是Prrx2基因。Prrx3基因表达于胚胎期的中胚层和外胚层，与骨和软骨的形成、大脑、脊髓、神经、心脏、颅面部和近端肢体的发育有关。Prrx3基因的甲基化与肺癌具有密切关系，可能成为肺癌的早期筛查指标。本研究旨在研究家兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的结构，表达图谱和在不同时期各组织的动态变化，为Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的进一步的研究和应用提供参考。本研究主要获得以下成果：1.本研究首次克隆得到新西兰白兔Prrx1a（登录号：KP726284）、Prrx1b（登录号：KM222500.1）、Prrx2和Prrx3（登录号：KP726285）基因，并对其DNA序列和氨基酸序列进行生物信息学的分析，预测其可能的生物活性、结构及功能。2.本研究分别构建了pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3四种原核表达载体，转化进入BL21感受态细胞。用IPTG进行诱导表达，优化IPTG诱导浓度、时间、温度。超声破碎，HistrapTMHP纯化柱进行纯化，并用Westernblot证实了融合蛋白的抗原性良好，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。3.本研究首次对新西兰白兔的常用的六个内参基因GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha、β-actin的表达稳定性进行比较。证实新西兰白兔不同的发育时期和组织中，最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时，可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-PCR数据的指标，以确保试验组个体间的差异最小，和小变量的准确数据分析。4.本研究首次用RT-PCR的方法确定不同发育阶段各器官中新西兰白兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因mRNA的表达量。并比较了部分器官中Prrx1的两种变异剪切体Prrx1a和Prrx1b的表达量差异。I 5.用免疫组化的方法证实Prrx家族蛋白在新西兰白兔各器官的表达。由于转录后调控，mRNA的表达量与蛋白在各器官的表达量并不完全相同。然而，由于缺乏有效的单克隆抗体，不能有效区别几种蛋白。关键词：新西兰白兔；成对相关同源异型框基因（Prrx）；克隆；生物信息学分析；融合蛋白表达；Westernblot分析；表达图谱；内参基因筛选II PrrxGeneFamilyofOryctolagusCuniculus:cloning,prokaryoticexpressionandExpressionPatternGraguateStudent：ChenRuiDirector：YangXiao-nongAbstractPrrx1(MHox,k2,Pmx,Prrx1),Prrx2(S8,Prx2)andPrrx3（Prx3,SHOX2,SHOT，OG12）arebelongtohighlyconservativeHomeoboxgenefamily.ThePrrx1nullmicehaveacleftpalateandmildhypoplasiaofboththemandibleandthezeugopodalbonesofthelimbs.Incontrast,thePrrx2nullmicearemorphologicallynormal,buthavemildcardiacfunctionaldeficits.ThephenotypeofthedoublemutantmiceshowedthatPrrx1andPrrx2eachplayaroleinspine,hyoidarch,craniofacial,aorticarch,hypophysisandlimbdevelopment.Someamphibianscanregenerateinjuredbodyparts,evenanamputatedlimb,withoutcicatrix.ThisperfecthealingprocessmayconcernPrrx1gene.Formammal,thegenethatcontributestofetalscarlesshealingprocessisPrrx2gene.Prrx3geneexpressesatmesodermandectodermembryo,andthisgeneplaysaroleincerebrum,spinalcord,nervesheart,craniofacialandproximallimbdevelopment.MethylationofPrrx3iscloselyrelatedwithincidenceoflungcancer,whichmakesitselfaninitialscreeningmethodoflungcancer.TheobjectiveofthisstudyistocloneandanalyzethestructureofPrrx1,Prrx2andPrrx3genes,andinvestigatetheirexpressionpatternsinOryctolaguscuniculus,whichcouldprovidesomevaluablereferencesforfurtherstudyforthesegenes.Thisstudymainlyachievedthefollowingachievements:1.Prrx1a（Accessionnumber:KP726284）,Prrx1b（Accessionnumber:KM222500.1）,Prrx2andPrrx3（Accessionnumber:KP726285）werecorrectlycloned.TheirDNAandaminoacidsequenceswereanlysisedbysoftwares.2.pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3recombinantplasmidswereconstructedandransferredintotheexpressionhostE.coliBL21.ExpressionoffusionproteinswereinducedbyIPTG,andexpressionconditions,suchasIPTGconcentration,timeandtemperaturewereoptimized.UltrasonicationofE.coliBL2andsubsequentlyHistrapTMHPpurificationwasperformed.GoodantigenicityoffusionproteinswereconfirmedbySDS–PAGEandWesternblot.III 3.Thisarticlehavedevelopedarankedprofileofthetopperforming6referencegenes(GAPDH,HPRT1,18SrRNA,B2M,Sdha,β-actin)bystableexpressionindifferentdevelopmentperiodsandtissuesinOryctolaguscuniculus.ThisstudyconfirmedthatthemoststablereferencegenesweredifferentindifferentperiodsandtissuesofNewZealandwhiterabbit.Toensureminimalvariationbetweenindividualsofanexperimentalgroupandtheaccuratestatisticalanalysisofsmallfoldchanges,werecommendnormalizingdatatothegeometricmeanofatleast3validatedreferencegenesasabovewhenrelatedNewZealandwhiterabbittrialswereperformed.4.ExpressionpatternsofPrrx1,Prrx1a,Prrx1b,Prrx2andPrrx3mRNAwereinvestigatedbyRT-PCRindifferentorgansandstagesinOryctolaguscuniculus.ExpressionoftwotransformsofPrrx1,Prrx1aandPrrx1b,werecompareinpartialorgans.5.ExpressionsofPrrx1,Prrx2andPrrx3proteinswereconfirmedindifferentorgansandstagesinOryctolaguscuniculusbyimmunohistochemistry.ExpressionsofPrrx1,Prrx2andPrrx3proteinswereinconformitywithmRNAbecauseofpost-transcriptionalcontrol.Nevertheless,adetailedlocalizationofPrrx1,Prrx2andPrrx3wasnotcarriedoutbecauseofalackofspecificantibodiesforeachfactor.Keywords:Oryctolaguscuniculus;Paired-relatedhomeboxgene(Prrx);cloning;bioinformaticsanalysis;Fusionproteinexpression;Westernblot;expressionpattern;referencegenescreeningIV 目录摘要··················································································ⅠAbstract··············································································Ⅲ第一章文献综述·································································11同源异型框基因············································································12Prrx基因家族···············································································13选题目的、主要内容和意义·····························································4第二章Prrx基因家族的克隆及生物信息学分析····················51材料·················································································51.1实验材料······································································51.2主要试剂······································································51.3主要实验仪器································································52方法·················································································62.1引物设计······································································62.2总RNA的提取和CDNA的合成·········································62.3目的基因的克隆测序·······················································62.4Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3蛋白的的生物信息学分析············83结果·················································································93.1家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因的克隆及同源性比对···93.2Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3蛋白的生物信息学分析·············134讨论···············································································265小结···············································································27第三章Prrx基因家族融合蛋白表达及Westernblot分析··············281材料··························································································281.1主要试剂···············································································281.2相关溶液配制·········································································282方法··························································································302.1重组表达载体的构建································································302.2融合蛋白的诱导表达································································302.3表达产物的SDS-PAGE检查······················································312.4重组蛋白的纯化······································································312.5重组蛋白的Westernblot检测·····················································313结果··························································································323.1pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒的双酶切鉴定结果·······32 3.2表达产物的SDS-PAGE检测······················································333.3纯化重组蛋白·········································································383.4重组蛋白的Westernblot检测结果···············································393.5pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3的质粒图谱····························404讨论··························································································425小结··························································································42第四章家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析·········431材料··············································································442方法··············································································442.1总RNA提取和CDNA合成·············································442.2引物的特异性鉴定及阳性标准品的制备······························442.3RT-PCR扩增·······························································452.4数据分析····································································453结果··············································································453.1内参基因引物的特异性··················································453.2各基因的扩增曲线和溶解曲线··········································463.3阳性标准品的制备及标准曲线的构建·································483.4内参基因在各组织不同时期的表达稳定性···························483.5内参基因在各时期不同组织的表达稳定性····································493.6内参基因在不同时期不同组织的表达稳定····································504讨论··············································································515小结··············································································52第五章Prrx1、Prrx2和Prrx3的表达图谱·······························531材料··············································································531.1实验动物····································································531.2实验器材····································································532方法··············································································532.1总RNA的提取和cDNA的合成················································532.2目的基因引物的特异性鉴定及阳性标准品的制备··························532.3目的基因RT-PCR的扩增·························································542.4数据处理····································································553结果··············································································553.1Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因引物的特异····553.2Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的扩增曲线和溶解曲线·································································································55 3.3Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因阳性标准品的制备和标准曲线的制作···············································································573.4Prrx1、Prrx1a和Prrx1b基因的表达图谱·····································583.5Prrx2基因的表达图谱······························································603.6Prrx3基因的表达图谱······························································614讨论··············································································615小结··············································································62第六章Prrx家族蛋白的免疫组化分析····································631材料··············································································631.1实验仪器····································································631.2主要试剂····································································631.3溶液配制····································································632方法··············································································632.1标本的取材及处理··································································632.2石蜡切片的制作·····································································642.3HE染色······································································642.4免疫组织化学检测··································································642.5结果观察··············································································653结果··············································································653.1新西兰白兔肝组织中Prrxs的表达··············································653.2新西兰白兔肾组织中Prrxs的表达··············································673.3新西兰白兔心组织中Prrxs的表达··············································683.4新西兰白兔肺组织中Prrxs的表达··············································703.5新西兰白兔脑组织中Prrxs的表达··············································713.6新西兰白兔脾组织中Prrxs的表达··············································724讨论··························································································735小结··························································································74全文结论·······························································75全文创新点·····························································79参考文献·······························································80攻读硕士期间发表的论文···········································87致谢·····································································88 缩略语表HoXHomeoboxgene同源异型框基因Prrx1Paired-relatedhomebox1成对相关同源异型框基因1Prrx2Paired-relatedhomebox2成对相关同源异型框基因2Prrx3Paired-relatedhomebox3成对相关同源异型框基因3cDNAcomplementaryDNA互补DNAPCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应Aadenine腺嘌呤Gguanine鸟嘌呤Tthymine胸腺嘧啶Ccytosine胞嘧啶bpbasepair碱基对aaaminoacid氨基酸ECLElectro-Chemi-Luminescence电化学显色液dodecylsulfatepolyacrylamideSDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳gelelectrophoresisreducedglyceraldehyde-phosphateGAPDH磷酸甘油醛脱氢酶dehydrogenaseHypoxanthinePhospho-ribosylHPRT1黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1Transferase1B2Mbeta-2-microglobulin微球蛋白Sdhasuccinatedehydrogenase琥珀酸脱氢酶β-actinbeta–actinβ-肌动蛋白 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第一章文献综述1同源异型框基因同源异型框基因[1]（Homeoboxgene，HoX）是控制细胞分化和形态发育的主要基因之一，位于遗传等级的较高层。主要涉及胚胎发育和分化的基因调控事件[2]。许多同源异型框基因都涉及肢体结构和器官的发育，例如肢体、眼睛、脊髓、和脑，通过有组织的计划和调控的定线方式[3,4]。组织发育的一个常见的主题是生长因子和多种同源异型框基因标记的感应信号之间的相互作用。一些同源异型框基因的表达可能限制于一些特殊的细胞系，有时会倾向于在成年动物表达[5-8]。同源异型框基因均包含183个核苷酸组成的高度保守的同源异型框序列，编码含有61个氨基酸组成的同源异型框结构域的核蛋白作为转录因子。同源异型框结构域包含的螺旋-转角-螺旋模序，通过识别，将螺旋插入DNA大沟，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控[1]。同源异型框基因编码DNA绑定转录因子，它们对多细胞动物细胞分化和胚胎形成具有重要作用[9]。Prrx1[10-13](Paired-relatedhomebox1、Prrx1)(MHox、k2、Pmx、Prrx1)，Prrx2[14-16](Paired-relatedhomebox2、Prrx2)(S8、Prx2)和Prrx3[17-19](Paired-relatedhomebox3、Prrx3)（Prx3、SHOX2、SHOT、OG12）就属于这些高度保守的是同源异型框基因转录因子。Prrx1和Prrx2在它们的同源结构域有97%相似。在整个分子有64%相似[15]。Prrx1有两种选择性拼接型，Prrx1a和Prrx1b，Prrx2和Prrx3只有一种。在大鼠和小鼠的预测Prrx3蛋白质预测序列中，都有同源异型区域，但有三个不同的N端，C端由12个氨基酸残基的变异，同源异型框蛋白无芒结构域亚家族的一个包含14个氨基酸残基的改变[17]。2Prrx家族小鼠垂体中的Prrx1和Prrx2最先出现在E13.5的胚胎拉克特囊（Rathke’spouch）[20]。Prrx1缺乏鼠有腭裂，脊柱骨骼缺陷和四肢，颌骨，桡尺骨和胫腓骨轻微的组织发育不良[21,22]。Prrx2缺乏小鼠基本无形态学变化，但有轻微的心肌功能异常[22]。1 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱两者都缺的表现型显示Prrx1和Prrx2在脊柱、舌骨弓[23]、颅面[24]、大动脉弓[25]、垂体[26]和肢体发育[24]都有重要作用。这些双缺陷鼠上腭的喙面缺陷，下颌骨只有一个切齿蕾状期牙齿胚芽和Meckel’s软骨缺失[23,27]、臼齿畸形、包括牙尖变化[23]和上皮异位。这些小鼠的头畸型有外耳、中耳、内耳发育不良[27]、还有畸形眼睑。而且桡骨极度发育不良、畸形。肢体畸形也包括多趾畸形或者少趾等畸形趾。心血管异常出现在大血管，有畸形动脉弓和动脉导管[24]，无明显的心脏发育异常[28]。Prrx1和Prrx2基因还涉及软骨膜和软骨细胞的相互作用，调节它们的增殖和分化[29]。Prrx1和Prrx2基因都可以被平滑肌细胞(smoothmusclecell，SMC)粘附调节，一起控制血管平滑肌细胞扩增和固生蛋白C表达，控制肺血管病的发生[30]。Prrx1和Prrx2蛋白还可以对上皮细胞基质间相互作用形成的初始组织的形态发生起到重要作用[31]。随着研究的不断深入，Prrx1和Prrx2越来越多的生物学功能被发现。RBMS3（RNAbindingmotif，singlestrandedinteractingprotein3，RBMS3）通过序列特异绑定Prrx1mRNA，控制Prrx1表达量和间接胶原合成，有助于肝脏纤维化[32]。Prrx1基因显示了与血清应答因子(serumresponsefactor，SRF)和TFII-I的相互作用，通过增强SRF与CArG序列的亲和力而调控平滑肌α肌动蛋白的表达[33-35]。Prrx1基因也涉及急性骨髓白血病的形成[36]。最近的研究表明，Prrx1通过激活TGF-β信号抑制脂肪形成，未来可能用于肥胖症的治疗[37]。临床对于伤口的无瘢痕愈合具有强烈需求，但无瘢痕愈合完成过程的分子因素仍然是未知的。胎儿皮肤创伤后的无瘢痕愈合是胎儿发育过程中特定阶段的特殊现象，它所涉及的细胞增殖，细胞外基质重组，基质金属蛋白酶2和透明质酸的产生都与Prrx基因相关[38]。即使是在截肢的情况下，一些两栖类动物的受损部位可以再生，而且没有瘢痕。这种完美的愈合过程涉及Prrx1基因[38]，但对于哺乳动物，在胚胎无瘢痕伤口愈合中起重要作用的是Prrx2基因[39]。KLF6显著地促进Prrx2基因表达，而基质衍生内皮素1信号限制Prrx2的表达[40,41]。基因芯片研究表明，Prrx2基因的靶蛋白是ProteaseNexin-1(PN-1)[42,43]。Prrx2和Prrx1b还可以促进斑马鱼胚胎血管肌浆球蛋白重链vmhc表达。Prrx3基因目前有较大争议，人的Shox2基因与小鼠Shox基因同源，但低于Shox2基因与OG12的同源性。Shox2与OG12编码的蛋白99%同源，而Shox与OG12编码2 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱的蛋白只有87%同源[17,18]。也就是说Shox2与小鼠Prrx3（之前被称为OG12）具有更高度的同源性，有可能是相同的基因。Prrx3基因表达于胚胎期的中胚层和外胚层，与骨和软骨的形成，大脑、脊髓、神经、心脏等器官的发育，以及颅面部的形成有关[44]。Prrx3基因缺失会引起Turnerz综合征，Léri–Weill综合症，Lange综合症等疾病骨骼发育异常[45-47]。Lange综合症的症状主要是唇鳄裂和上颌骨裂[47-50]。在胚胎肢体发育的过程中，Prrx3主要对近端肢体发挥作用[51,52]。条件性敲除小鼠Prrx3在发育软骨细胞会导致近端骨较短（例如，肱骨、股骨），而远端肢体相对不受影响[53]。这种畸形是由于软骨细胞过早成熟和增厚[54]。Bmp4基因是Prrx3直接靶标。但外源性Bmp4供应可以克服骨发育前Prrx3消耗引起的成熟和增厚的障碍[55]。Hox和Prrx3有空间表达动力联合，Prrx3表达限制在前肢，和Hoxd9和Hoxa11一起表达，并列远侧有Hoxa13和Hoxd13的表达[56]。缺少Prrx3功能的肢体中，骨骼附属结构（如肌肉、神经等）的发育也会出现异常。因此，Prrx3不仅是骨骼发育所必需的，也是其附属结构的发育所必需的[52]。另外Prrx3还影响及颞颌关节和牙胚的发育。Prrx3基因和人、鼠牙胚发育的各种调控基因（如Bmp4、FCF8、MSX1和PAX9）的表达方式虽然有些不同，但是大部分一样。Prrx3对小鼠牙齿的发育有何种影响以及作用机制目前尚不清楚[57-59]。Prrx3在心脏发育的早期阶段发挥作用，与心律的快慢有关[60]。在小鼠胚胎5.5d时，Prrx3在心脏发生过程中限制性，并特异性的在静脉窦区域表达，敲除Prrx3基因导致胚胎心脏发育缺陷，包括窦房结（sinoatrialnode，SAN）发育缺陷。胚胎会因SAN分化障碍以及起搏器功能下降引起先天性心脏缺陷而死亡[60,61]。而且Prrx3磷酸化是其控制窦房结功能所必须的[62]。Prrx3在皮下脂肪库，肾周围组织，腹腔内肠系膜周围表达依次降低，不同的脂肪库有不同的发育基因控制，这表明Prrx3参与脂肪分布和脂肪库的发育[61]。虽然Prrx3基因主要影响胚胎的生长发育。最近研究表明，Prrx3基因对肺脏的生命活动也有重要影响。Prrx3-/-胚胎肺部发育极性颠倒，肺末梢出现多个支气管、细支气管样结构，不能形成成熟的、有功能的大肺泡。Prrx3基因的高甲基化与肺癌具有密切关系，可能成为肺癌的早期筛查指标。目前正在研究血浆中Prrx3基因甲基化对肺癌的诊断和监测的方法的建立[63-65]。3 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱3选题目的、主要研究内容和意义本论文旨在研究新西兰白兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的基本功能，表达图谱和在不同时期各组织的动态变化。主要内容包括克隆新西兰白兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因，对所得到的基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析及预测，探究其可能的生物功能，并利用RT-PCR和免疫组化的方法检测各基因在不同阶段，不同器官的表达图谱。本研究构建了pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合表达载体，进行BL21细胞系的原核表达，并对诱导表达的温度、时间和IPTG浓度进行优化。同时，进行Westernblot实验，对原核表达的pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白的抗原性进行检测。家兔是重要的实验动物，家兔耳可以产生独特的、与人类增生性瘢痕相似的病理改变，对病理性瘢痕的研究具有不可替代的作用[66]。Prrxs在小鼠、人、鸡和猪中都已经有研究报道，但Prrxs在家兔上研究国内外尚未见报道。本研究首次克隆新西兰白兔Prrxs，探究新西兰白兔Prrxs基因在各器官的表达图谱，并对所得到的序列进行生物信息学分析及预测，为今后深入研究家兔Prrx1、Prrx2基因在发育生物学和无瘢痕愈合，Prrx3与发育生物学和作为肺癌的早期筛查指标等诸多方面的研究和机制提供参考。4 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第二章PRRX基因家族的克隆及生物信息学分析根据GeneBank上已经有的参考序列XM_002715470.2、XM_008264097.1、XM_008251719.1和XM_008266391.1的显示，家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3基因组全长分别为4958bp、1823bp、838bp（部分）和2740bp。开放阅读框长度分别为738bp、654bp、471bp（部分）和666bp。去除终止密码子不编码氨基酸，各开放阅读框应当分别编码245aa、217aa、156aa（部分）和221aa。本研究首次克隆家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3，为今后进一步研究家兔Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的功能、机理和基因工程等方面的研究打下理论基础。1材料1.1实验材料怀孕20d的新西兰白兔一只，购自华西实验动物中心。1.2主要试剂FirstStandcDNASysthesisKit反转录试剂盒、PrimeSTAR®MaxDNAPolymeraseDNA高保真聚合酶、dATP、末端转移酶、PremixTaq™(ExTaq™Version2.0plusdye)、pMD19-TVector、XhoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、D2000DNAMarker、T4DNA连接酶、RNAisoReagent均购自TaKara宝生物工程（大连）有限公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；1kbLadderDNAmaerker，DNAmarkerⅠ、大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。DEPC购自成都康迪生物科技有限公司、pET-32a(+)载体由本实验室保存。1.3主要仪器超纯水仪Milli-Q（Millipore，法国）；隔水式恒温培养箱（齐欣，中国）；-80℃超低温冰箱（SANYO，日本）；高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；恒温水浴器（国华电器，中国）；梯度PCR仪HybaidPX2（ThermoElectron，美国）；恒温金属浴仪（博日公司，中国）；凝胶成像系统VerSaDoc2000（Bio-Rad，美国）；移液器（Eppendorf，德国）；超净工作台（安泰，中国）；核酸电泳仪powerpacuniversalTM5 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱（Bio-Rad，美国）。高压灭菌锅(上海博迅，中国)。分光光度计（BioSpec-nano，日本）。2方法2.1引物设计根据Genbank中的Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因序列，利用Primer5软件，分析设计4对引物，见表2-1。5’端引入BamHⅠ酶切位点，Prrx1a、Prrx1b和Prrx23’端引入XhoⅠ酶切位点，Prrx33’端引入EcoRⅠ酶切位点。下划线序列为引入的酶切位点和保护性碱基。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及扩增片段大小见表2-1。表2-1引物序列Table2-1Primersequences基因引物序列长度登录号内切酶AmplicanAccessionRestrictiongenesPrimersequences(5'-3')length(bp)numberenzymeF1:CGCGGATCCATGACCTCCAGCTACGGGCACBamHIPrrx1a738XM_002715470.2R1:CCGCTCGAGTCAGTTGACTGTTGGCACCTGGTXhoIF2:CGCGGATCCATGACCTCCAGCTACGGGCACBamHIPrrx1b654XM_008264097.1R2:CCGCTCGAGTTAGAATCCGTTATGAAGCCCXhoIF3:CGCGGATCCGCGGCCAAGCGGAAGAAGBamHIPrrx2471XM_008251719.1R3:CCGCTCGAGTCAGTTCACGGTGGGCACXhoIF4:CGCGGATCCATGGGCGCCGCCGAGAGBamHIPrrx3666XM_008266391.1R4:CCGGAATTCTCACAGACCCAGGGCAGCCEcoRI2.2总RNA的提取和cDNA的合成取新西兰白兔胚胎和成年肾、心、肝各50mg剪碎后各加入1mLRNAisoReagent，提取总RNA。获得的RNA用50μLDEPC水稀释，-80℃保存。使用分光光度计测定RNA的浓度和质量。并用琼脂糖凝胶电泳测定28S/18S核糖体RNA的比值对RNA完整度进行评估。所有的RNA样品的OD260/OD280比值都在1.7-2.0之间，而且RNA的完整度较高。cDNA的合成按RTReagents试剂盒说明书进行，置于-20℃保存。2.3目的基因的克隆测序2.3.1目的基因的扩增和琼脂糖凝胶回收使用获得的cDNA进行PCR反应扩增，Prrx1a、Prrx1b和Prrx3采用总体积25μL的反应体系如表2-2：6 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱表2-2Prrx1a、Prrx1b和Prrx3的PCR反应体系Table2-2PCRreactionsystemforPrrx1a、Prrx1bandPrrx3试剂体积（μL）RegentVolumeExTaq™Version2.0plusdye12.5ddH2O8.5F1R1DNA2Prrx2含有较高的GC含量，PCR扩增时使用适用于高GC含量DNA片段的LATaq酶和GCBufferⅠ。总体积为50μL的反应体系，如表2-3：表2-2Prrx2的PCR反应体系Table2-2PCRreactionsystemforPrrx2试剂体积（μL）RegentVolumeLATaq0.52×GCBufferⅠ25dNTP8ddH2O10.5F2R2DNA2PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性40s，退火（Prrx1a57℃；Prrx1b55℃；Prrx258℃；Prrx356℃）40s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。由于本实验采用了高保真酶，固在TA克隆前需要在DNA片断末端加A。PCR产物的3’末端加A体系如表2-4所示：表2-4DNA3’末端转移酶体系Table2-4TDTsystemfor3’terminalofDNA试剂体积（μL）ReagentVolumePCRpruduct25TDT110×Buffer3dATP1以上试剂在PCR仪中反应37℃，30min。反应结束后，取5μLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳使用100V，80mA，30min。获得与预期结果大小相符7 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱的目的条带，进行胶回收纯化。胶回收用AxygenDNA凝胶回收试剂盒进行，严格按照试剂盒说明书进行操作。回收产物置于-20℃保存备用。2.3.2目的基因的TA平末端连接琼脂糖凝回收产物与pMD19-TVector质粒载体在微量薄壁反应管中进行连接。16℃金属浴中连接1h，构建重组质粒。连接体系如表2-5:表2-5平末端连接体系Table2-5blunt-endligationsysterm试剂体积（μL）ReagentVolumepMD19-TVector1DNA4LigationSolutionⅠ5总反应体系体积为10μL，连接产物转化至大肠杆菌DH5α。2.3.3转化大肠杆菌DH5α感受态细胞将连接产物缓慢螺旋加入感受态细胞中，避免反复吹打。在冰上放置30min后，42℃热击75s。再置于冰上放置3min。加入不含Amp的液体LB890μL，在恒温震荡培养箱中37℃，160～220r/min震荡培养1.5h。4000r/min离心2min，弃去850μL上清，将菌体重悬后转移至含Amp的固体LB培养基上，涂抹均匀，37℃培养箱倒置培养18h。挑取单菌落，进行菌落PCR验证，阳性菌落送至上海生工生物工程测序。阳性的克隆载体分别命名为pMD19-T-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3。2.4Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3蛋白质的生物信息学分析使用DNAMAN进行家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3氨基酸序列与人，鼠兔，小鼠的Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3氨基酸序列同源性比对。通过PBIL-IBCP网站的NetworkProteinSequenceAnalysis在线软件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）分析家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3氨基酸序列的二级结构；通过在线软件SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）分析家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3蛋白的三级结构。通过Protparamg工具（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）对家兔Prrx1a、Prrx1b、PRRX2、PRRX3氨基酸序列的理化性质进行分析。使用CBS网站（http://www.cbs.dtu.dk/index.shtml）的NetNGlyc1.0工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx38 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱氨基酸序列糖基化位点，使用NetNGlyc2.0工具分析家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列磷酸化位点。用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列信号肽，用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/预测Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列跨膜区域。用http://crdd.osdd.net/raghava/bcepred/bcepred_submission.html网站的在线软件BCEPRED预测该Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列的B细胞抗原表位。3结果3.1家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因的克隆与同源性比对以获得的cDNA为模板，使用F1-F4作为引物，进行PCR反应，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2-1所示。图2-1Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因的PCR结果Fig.2-1PCRresultofPrrx1a,Prrx1b,Prrx2andPrrx3genesNote:Mmarker;1Prrx1a;2Prrx1b;3Prrx2;4Prrx3克隆得到Prrx1a基因并上传至GeneBank（登录号：KP726284）。使用DNAMAN软件，将得到的家兔Prrx1a氨基酸序列与人、小鼠、鼠兔对比，同源性对比结果如图2-2。由结果可知，家兔Prrx1a氨基酸与小鼠、鼠兔Prrx1a氨基酸相比，C端有较高的同源性，可能是家兔Prrx1a氨基酸的保守区域。而N端序列同源性较低，可能是家兔Prrx1a氨基酸的特异区域。人Prrx1a氨基酸的C端较短。9 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱Oryctolagus_cuniMTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50Homo_Prrx1a.pro...............................................MVA3Mus_musculus_PrrMTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50Ochotona_princepMTSSYAHVLERQPALGGRLDSPGNLDSLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50ConsensusmvaOryctolagus_cuniAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100Homo_Prrx1a.proAQADENVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT53Mus_musculus_PrrAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100Ochotona_princepAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100ConsensusaqadevgeagrsllespgltsgsdtpqqdndqlnseekkkrkqrrnrttOryctolagus_cuniFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150Homo_Prrx1a.proFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR103Mus_musculus_PrrFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150Ochotona_princepFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150ConsensusfnssqlqalervferthypdafvredlarrvnltearvqvwfqnrrakfrOryctolagus_cuniRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYS200Homo_Prrx1a.proRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYS153Mus_musculus_PrrRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYS200Ochotona_princepRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYS200ConsensusrneramlanknasllksysgdvtaveqpivprpaprptdylswgtaspysOryctolagus_cuniAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTV244Homo_Prrx1a.proAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTV197Mus_musculus_PrrAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTV244Ochotona_princepAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTV244Consensusamatysatcannspaqginmansianlrlkakeyslqrnqvptv图2-2人，鼠，鼠兔，家兔Prrx1a氨基酸的同源性对比结果Fig.2-2SequencecomparisonbetweentheOryctolaguscuniculusPrrx1a,HomoPrrx1a,MusPrrx1aandOchotonaPrrx1apolypeptides.克隆得到Prrx1b基因并上传至GeneBank（登录号：KM222500.1）。使用DNAMAN软件，将得到的家兔Prrx1b氨基酸序列与人、小鼠、鼠兔Prrx1b氨基酸对比，同源性对比结果如图2-3。由结果可知，家兔Prrx1b氨基酸与人、小鼠、鼠兔Prrx1b氨基酸相比，有相似的C端，局部有较高的同源性。可能是家兔Prrx1b氨基酸的保守区域。而N端序列同源性较低，可能是家兔Prrx1b氨基酸的特异区域。10 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱Homo_Prrx1b.proMTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50Mus_Prrx1b.proMTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50Ochotona_Prrx1b.MTSSYAHVLERQPALGGRLDSPGNLDSLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50Oryctolagus_PrrxMTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVA50ConsensusmtssyhvlerqpalggrldspgnldlqakknfsvshlldleeagdmvaHomo_Prrx1b.proAQADENVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100Mus_Prrx1b.proAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100Ochotona_Prrx1b.AQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100Oryctolagus_PrrxAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTT100ConsensusaqadevgeagrsllespgltsgsdtpqqdndqlnseekkkrkqrrnrttHomo_Prrx1b.proFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150Mus_Prrx1b.proFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150Ochotona_Prrx1b.FNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150Oryctolagus_PrrxFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFR150ConsensusfnssqlqalervferthypdafvredlarrvnltearvqvwfqnrrakfrHomo_Prrx1b.proRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYS200Mus_Prrx1b.proRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYR200Ochotona_Prrx1b.RNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYR200Oryctolagus_PrrxRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYR200ConsensusrneramlanknasllksysgdvtaveqpivprpaprptdylswgtaspyHomo_Prrx1b.proAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTV244Mus_Prrx1b.proS.SSLPRCCLHEGLHNGF..........................217Ochotona_Prrx1b.S.SSLPRCCLHEGLHNGF..........................217Oryctolagus_PrrxS.SSLPRCCLHEGLHNGF..........................217Consensuscg图2-3人，鼠，鼠兔，家兔Prrx1b氨基酸的同源性对比结果Fig.2-3SequencecomparisonbetweentheOryctolaguscuniculusPrrx1b,HomoPrrx1b,MusPrrx1bandOchotonaPrrx1bpolypeptides.由于GeneBank上缺少Prrx2基因的全基因序列，而且5’RACE克隆未获得成功，本研究主要克隆得到Prrx2基因的部分已知序列。使用DNAMAN软件，将得到的家兔Prrx2氨基酸序列与人、小鼠、鼠兔Prrx2氨基酸对比，同源性对比结果如图2-4。由结果可知，家兔Prrx2氨基酸与人、小鼠、鼠兔Prrx2氨基酸相比，有相似的N端，局部有较高的相似性。可能是Prrx2氨基酸的保守区域。而已知的C端序列较短，无法观察该相对特异区域的同源性大小和相关生物信息学分析。11 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱Homo_Prrx2.proMDSAAAAFALDKPALGPGPPPPPPALGPGDCAQARKNFSVSHLLDLEEVA50Mus_Prrx2.proMDSAAAAFALDPPAPGPGPPP.....APGDCAQARKNFSVSHLLDLEEVA45Ochotona_Prrx2.pMREA............PG........G..........FSQSH........12Rabbit_Prrx2.pro..................................................0ConsensusHomo_Prrx2.proAAGRLAARPGA.RAEAREGAAREPSGGSSGSEAAPQDGECPSPGRGSAAK99Mus_Prrx2.proAAGRRAAGPVSGPAEAREGAAREPSGGSSGSEAAPQDGDCPSPGRG..TK93Ochotona_Prrx2.p...RLARRK............................SECPSPGRGGAAK31Rabbit_Prrx2.pro...............................................AAK3ConsensuskHomo_Prrx2.proRKKKQRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREELARRVNLSEARVQ149Mus_Prrx2.proRKKKQRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREELARRVNLSEARVQ143Ochotona_Prrx2.pRKKKQRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREELARRVNLSEARVQ81Rabbit_Prrx2.proRKK.QRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREELARRVNLSEARVQ52ConsensusrkkqrrnrttfnssqlqalervferthypdafvreelarrvnlsearvqHomo_Prrx2.proVWFQNRRAKFRRNERAMLASRSASLLKSYSQEAAIEQPVAPRPTALSPDY199Mus_Prrx2.proVWFQNRRAKFRRNERAMLATRSASLLKSYGQEAAIEQPVAPRPTTMSPDY193Ochotona_Prrx2.pVWFQNRRAKFRRNERAMLANRSASLLKSYSQEAAIEQPMAPRPTTLSSDY131Rabbit_Prrx2.proVWFQNRRAKFRRNERAMLANRSASLLKSYSQEAAMEQPVAPRPTALSPDY102ConsensusvwfqnrrakfrrneramlarsasllksyqeaaeqpaprptsdyHomo_Prrx2.proLSWTASSPYSTVPPYSPGSSGPATPGVNMANSIASLRLKAKEFSLHHSQV249Mus_Prrx2.proLSWPASSPYSSVPPYSPGGSSPATPGVNMANSIASLRLKAKEFSLHHSQV243Ochotona_Prrx2.pLSWTASSPYSSVPPYSPGSSGPATPGVNMANSIASLRLKAKEFSLHHSQV181Rabbit_Prrx2.proLSWTASSPYSSVTPYSPGGSGPATPGVNMANSIASLRLKAKEFSLHHSQV152ConsensuslswasspysvpyspgspatpgvnmansiaslrlkakefslhhsqvHomo_Prrx2.proPTV252Mus_Prrx2.proPTV246Ochotona_Prrx2.pPTV184Rabbit_Prrx2.proPTV155Consensusptv图2-4人，鼠，鼠兔，家兔Prrx2氨基酸的同源性对比结果Fig.2-3SequencecomparisonbetweentheOryctolaguscuniculusPrrx2,HomoPrrx2,MusPrrx2andOchotonaPrrx2polypeptides.克隆得到Prrx3基因并上传至GenBank登录号为（登录号：KP726285）。与敲除内含子预测序列（XM_008266391.1）相比第463位由C变成了T，但是改变的核酸不引起氨基酸序列的改变。将得到的家兔Prrx3氨基酸序列与人、小鼠和鼠兔Prrx3氨基酸对比，同源性对比结果如图2-5。由结果可知，家兔Prrx3氨基酸与人、小鼠Prrx3氨基酸相比，家兔Prrx3氨基酸有相似的N端，而C端较短，各物种C端局部有较高的特异性。Prrx3蛋白的功能域位于C端，N端未见明显活性[51]。12 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱Homo_Prrx3.proMEELTAFVSKSFDQKVKEKKEAITYREVLESGPLRGAKEPTGCTEAGRDD50Mus_Prrx3.proMEELTAFVSKSFDQKVKEKKEAITYREVLESGPLRGAKEPG.CVEPGRDD49Ochotona_Prrx3.pMEELTAFVSKSFDQKVKEKKEAITYREVLESGPLRGAKEPGGCAEPGRDD50Rabbit_Prrx3.pro..................................................0ConsensusHomo_Prrx3.proRSSPAVRAAGGGGG.GGGGGGGGGGGGGVGGGGAGGGAGGGRSPVRELDM99Mus_Prrx3.proRSSPAVRAAGGGGGAGGGGGGGGGGGGGAGGGGAGGGAGGGRSPVRELDM99Ochotona_Prrx3.pRSSPAVRAAGGGGG....GGGGGGGGAGGGGGGAGGGAGGGRSPGRELDM96Rabbit_Prrx3.pro.................................................M1ConsensusmHomo_Prrx3.proGAAERSREPGSPRLTEGRRKPTKAEVQATLLLPGEAFRFLVSPELKDRKE149Mus_Prrx3.proGAAERSREPGSPRLTE........................VSPELKDRKD125Ochotona_Prrx3.pGAAERSREPGSPRLTE........................VSPELKDRKE122Rabbit_Prrx3.proGAAERSREPGSPRLTE........................VSPELKDRKE27ConsensusgaaersrepgsprltevspelkdrkHomo_Prrx3.proDAKGMEDEGQTKIKQRRSRTNFTLEQLNELERLFDETHYPDAFMREELSQ199Mus_Prrx3.proDAKGMEDEGQTKIKQRRSRTNFTLEQLNELERLFDETHYPDAFMREELSQ175Ochotona_Prrx3.pDAKGMEDEGQTKIKQRRSRTNFTLEQLNELERLFDETHYPDAFMREELSQ172Rabbit_Prrx3.proDAKGMEDEGQTKIKQRRSRTNFTLEQLNELERLFDETHYPDAFMREELSQ77ConsensusdakgmedegqtkikqrrsrtnftleqlnelerlfdethypdafmreelsqHomo_Prrx3.proRLGLSEARVQVWFQNRRAKCRKQENQLHKGVLIGAASQFEACRVAPYVNV249Mus_Prrx3.proRLGLSEARVQVWFQNRRAKCRKQENQLHKGVLIGAASQFEACRVAPYVNV225Ochotona_Prrx3.pRLGLSEARVQVWFQNRRAKCRKQENQLHKGVLIGAASQFEACRVAPYVNV222Rabbit_Prrx3.proRLGLSEARVQVWFQNRRAKCRKQENQLHKGVLIGAASQFEACRVAPYVNV127ConsensusrlglsearvqvwfqnrrakcrkqenqlhkgvligaasqfeacrvapyvnvHomo_Prrx3.proGALRMPFQQDSHCNVTPLSFQVQAQLQLDSAVAHAHHHLHPHLAAHAPYM299Mus_Prrx3.proGALRMPFQQDSHCNVTPLSFQVQAQLQLDSAVAHAHHHLHPHLAAHAPYM275Ochotona_Prrx3.pGALRMPFQQDSHCNVTPLSFQVQAQLQLDSAVAHAHHHLHPHLAAHAPYM272Rabbit_Prrx3.proGALRMPFQQ............VQAQLQLDSAVAHAHHHLYPHLAAHAPYM165ConsensusgalrmpfqqvqaqlqldsavahahhhlphlaahapymHomo_Prrx3.proMFPAPPFGLPLATLAADSASAASVVAAAAAAKTTSKNSSIADLRLKAKKH349Mus_Prrx3.proMFPAPPFGLPLATLAADSASAASVVAAAAAAKTTSKNSSIADLRLKAKKH325Ochotona_Prrx3.pMFPAPPFGLPLATLAADSASAASVVAAAAAAKTTSKNSSIADLRLKAKKH322Rabbit_Prrx3.proMFPAPPFGLPLATLAADSASAASVVAAAAAAKTTSKNSSIADLRLKAKKH215ConsensusmfpappfglplatlaadsasaasvvaaaaaakttsknssiadlrlkakkhHomo_Prrx3.proAAALG354Mus_Prrx3.proAAALG330Ochotona_Prrx3.pAAALG327Rabbit_Prrx3.proAAALG220Consensusaaalg图2-5人，鼠，鼠兔，家兔Prrx3氨基酸的同源性对比结果Fig.2-3SequencecomparisonbetweentheOryctolaguscuniculusPrrx3,HomoPrrx3,MusPrrx3andOchotonaPrrx3polypeptides.3.2Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3蛋白质的生物信息学分析3.2.1基本理化性质分析扩增得到Prrx1a基因开放阅读框全长738bp。通过http://web.expasy.org/protparam/等生物信息学在线软件对其基本理化性质进行了分析。结果显示，编码氨13 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱基酸245个，分子量27.269KD，理论等电点为9.48。Prrx1a的氨基酸组成中，正电荷氨基酸残基为33个，负电荷氨基酸残基为27个，整个蛋白带正电荷。蛋白不稳定系数为55.67，该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx1a拟表达蛋白分子式为C1171H1881N363O377S6。N端为Met，C端为Asn。扩增得到Prrx1b开放阅读框全长654bp。通过http://web.expasy.org/protparam/等生物信息学在线软件对其基本理化性质进行了分析。结果显示，编码氨基酸217个，分子量24.369KD，理论等电点为9.17。Prrx1b的氨基酸组成中，正电荷残基为31个，负电荷残基为27个，整个蛋白带正电荷。蛋白不稳定系数为59.99，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx1b拟表达蛋白分子式为C1049H1674N328O333S5。N端为Met，C端为Phe。扩增得到Prrx2基因部分开放阅读框471bp（125-596）。通过http://web.expasy.org/protparam/等生物信息学在线软件对其基本理化性质进行了分析。结果显示，该Prrx2部分阅读框编码氨基酸156个，分子量17.620KD。理论等电点为11.08。氨基酸组成中，正电荷残基为25个，负电荷残基为11个，整个蛋白带正电荷。蛋白不稳定系数为65.98，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx2拟表达多肽分子式为C770H1228N242O228S3。N端为Ala，C端为Asn。扩增得到Prrx3基因开放阅读框全长666bp，（GenBank登录号为登录号:KP726285）。与敲除内含子预测序列（XM_008266391.1）相比，第463位由C变成了T，但是不引起氨基酸序列的改变。通过http://web.expasy.org/protparam/等生物信息学在线软件对其基本理化性质进行了分析。结果显示，Prrx3编码氨基酸221个，分子量24.404KD，理论等电点为9.42。Prrx3氨基酸组成中，正电荷残基为30个，负电荷残基为24个，整个蛋白带正电荷。蛋白不稳定系数为52.35，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx3拟表达多肽链的分子式为C1068H1712N324O316S8。N端为Met，C端为Leu。3.2.2家兔Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3氨基酸的亲/疏水性，柔韧性/抗原性预测用DNAStar软件子程序Prostean对Prrx1a氨基酸的亲/疏水性，柔韧性/抗原性进行预测。由图2-6可知，Prrx1a蛋白疏水性残基所占比例大于亲水性残基，因此推测14 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱其编码蛋白整体表现为疏水性。柔韧性区域分布相对均匀。抗原表位区域较大，与柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区域相对易于变形，便于抗原、抗体的自由结合，可能是抗原位点的富集区。序列上含有较多的α螺旋区域，β折叠区域以及转角，结构较为复杂。值得注意的是，在98-152位氨基酸的同源异型框结构域包含一个螺旋-转角-螺旋模式序列，它可能是通过识别将螺旋插入DNA大沟的同源异型框序列，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。20406080100120140160180200220240AAlpha,Regions-Garnier-RobsonAAlpha,Regions-Chou-FasmanBBeta,Regions-Garnier-RobsonBBeta,Regions-Chou-FasmanTTurn,Regions-Garnier-RobsonTTurn,Regions-Chou-FasmanCCoil,Regions-Garnier-Robson4.50HydrophilicityPlot-Kyte-Doolittle-4.5*Alpha,AmphipathicRegions-Eisenberg*Beta,AmphipathicRegions-EisenbergFFlexibleRegions-Karplus-Schulz1.70AntigenicIndex-Jameson-Wolf-1.761SurfaceProbabilityPlot-Emini0图2-6家兔Prrx1a蛋白亲水性、柔韧性及抗原性的预测结果Fig.2-6Predictresultsofhydrophilicity,flexibility,surfaceprobabilityandantigenicityofPrrx1ainOryctolaguscuniculus用DNAStar软件子程序Prostean对Prrx1b氨基酸的亲/疏水性，柔韧性/抗原性进行预测，由图2-7可知，Prrx1b蛋白疏水性残基所占比例大于亲水性残基，因此推测其编码蛋白整体表现为疏水性。柔韧性区域分布相对均匀。抗原表位区域较大，与柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区域相对易于变形，便于抗原、15 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱抗体的自由结合，可能是抗原位点的富集区。序列上含有较多的α螺旋区域，β折叠区域以及转角，结构较为复杂。值得注意的是，在99-153位氨基酸的同源异型框结构域包含一个螺旋-转角-螺旋模式序列，它可以通过识别将螺旋插入DNA大沟，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。102030405060708090100110120130140150160170180190200210AAlpha,Regions-Garnier-RobsonAAlpha,Regions-Chou-FasmanBBeta,Regions-Garnier-RobsonBBeta,Regions-Chou-FasmanTTurn,Regions-Garnier-RobsonTTurn,Regions-Chou-FasmanCCoil,Regions-Garnier-Robson4.50HydrophilicityPlot-Kyte-Doolittle-4.5*Alpha,AmphipathicRegions-Eisenberg*Beta,AmphipathicRegions-EisenbergFFlexibleRegions-Karplus-Schulz1.70AntigenicIndex-Jameson-Wolf-1.761SurfaceProbabilityPlot-Emini0图2-7家兔Prrx1b蛋白亲水性、柔韧性及抗原性的预测结果Fig.2-7Predictresultsofhydrophilicity,flexibility,surfaceprobabilityandantigenicityofPrrx1binOryctolaguscuniculus用DNAStar软件子程序Prostean对Prrx2氨基酸的亲/疏水性，柔韧性/抗原性进行预测由图2-8可知，Prrx2蛋白疏水性残基所占比例大于亲水性残基，因此推测其编码蛋白整体表现为疏水性。柔韧性区域分布相对均匀。抗原表位区域较大，与柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区域相对易于变形，便于抗原、抗体的自由结合，可能是抗原位点的富集区。序列上含有较多的α螺旋区域，β折叠区域以及转角，结构较为复杂。值得注意的是，在8-61位氨基酸的同源异型框结构域包含一个螺旋-转角-螺旋模式序列，它可以通过识别将螺旋插入DNA大沟，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。16 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱102030405060708090100110120130140150AAlpha,Regions-Garnier-RobsonAAlpha,Regions-Chou-FasmanBBeta,Regions-Garnier-RobsonBBeta,Regions-Chou-FasmanTTurn,Regions-Garnier-RobsonTTurn,Regions-Chou-FasmanCCoil,Regions-Garnier-Robson4.50HydrophilicityPlot-Kyte-Doolittle-4.5*Alpha,AmphipathicRegions-Eisenberg*Beta,AmphipathicRegions-EisenbergFFlexibleRegions-Karplus-Schulz1.70AntigenicIndex-Jameson-Wolf-1.761SurfaceProbabilityPlot-Emini0图2-8家兔Prrx2蛋白亲水性、柔韧性及抗原性的预测结果Fig.2-8Predictresultsofhydrophilicity,flexibility,surfaceprobabilityandantigenicityofPrrx2inOryctolaguscuniculus用DNAStar软件子程序Prostean对Prrx3氨基酸的亲/疏水性，柔韧性/抗原性进行预测，如图2-9所示，Prrx3蛋白疏水性残基所占比例大于亲水性残基，因此推测其编码蛋白整体表现为疏水性。柔韧性区域分布相对均匀。抗原表位区域较大，与柔韧性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区，这些区域相对易于变形，便于抗原、抗体的自由结合，可能是抗原位点的富集区。序列上含有较多的α螺旋区域，β折叠区域以及转角，结构较为复杂。值得注意的是，在8-61位氨基酸的同源异型框结构域包含一个螺旋-转角-螺旋模式序列，它可以通过识别将螺旋插入DNA大沟，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控。17 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱102030405060708090100110120130140150160170180190200210220AAlpha,Regions-Garnier-RobsonAAlpha,Regions-Chou-FasmanBBeta,Regions-Garnier-RobsonBBeta,Regions-Chou-FasmanTTurn,Regions-Garnier-RobsonTTurn,Regions-Chou-FasmanCCoil,Regions-Garnier-Robson4.50HydrophilicityPlot-Kyte-Doolittle-4.5*Alpha,AmphipathicRegions-Eisenberg*Beta,AmphipathicRegions-EisenbergFFlexibleRegions-Karplus-Schulz1.70AntigenicIndex-Jameson-Wolf-1.761SurfaceProbabilityPlot-Emini0图2-9家兔Prrx3蛋白亲水性、柔韧性及抗原性的预测结果Fig.2-9Predictresultsofhydrophilicity,flexibility,surfaceprobabilityandantigenicityofPrrx3inOryctolaguscuniculus3.2.3信号肽和跨膜区域分析用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析Prrx1a信号肽，用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/预测Prrx1a跨膜区域。结果显示Prrx1a蛋白不含信号肽和跨膜区域，提示Prrx1a蛋白不是跨膜蛋白，如图2-10。图2-10家兔Prrx1a蛋白的信号肽和跨膜区域分析Fig.2-10SignalPandwebsequnceanalysisofPrrx1ainOryctolaguscuniculus在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析信号肽，用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/预测跨膜区域。结果Prrx1b蛋白不含信号肽和跨膜区域，提示Prrx1b蛋白不是跨膜蛋白，如图2-11。18 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-11家兔Prrx1b蛋白的信号肽和跨膜区域分析Fig.2-11SignalPandwebsequnceanalysisofPrrx1binOryctolaguscuniculus在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析信号肽，用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/预测跨膜区域。结果Prrx2蛋白不含信号肽和跨膜区域，提示Prrx2蛋白不是跨膜蛋白，如图2-12。图2-12家兔Prrx2蛋白的信号肽和跨膜区域分析Fig.2-12SignalPandwebsequnceanalysisofPrrx2inOryctolaguscuniculus在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析信号肽，用在线软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/预测跨膜区域。结果Prrx3蛋白不含信号肽和跨膜区域，提示Prrx3蛋白不是跨膜蛋白，如图2-13。图2-13家兔Prrx3蛋白的信号肽和跨膜区域分析Fig.2-13SignalPandwebsequnceanalysisofPrrx3inOryctolaguscuniculus19 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱3.2.4糖基化位点和磷酸化位点分析通过CBS网站的CBSPredictionServers分析该Prrx1a蛋白质的糖基化位点。使用NetNGlyc1.0工具分析发现Prrx1a糖基化位点有3个，其中第2位（97NRTT）和第3位（102NSSQ）的可能性最大。使用NetNGlyc2.0工具分析磷酸化位点，发现Prrx1a蛋白存在3个相关氨基酸的磷酸化位点。丝氨酸(Ser)有13个位点（21，35，56，63，67，72，86，167，192，197，200，213，223），酪氨酸(Tyr)有3个位点（118，190，199），苏氨酸(Thr)有3个位点（71，76，116），如图2-14。图2-14家兔Prrx1a蛋白质的糖基化位点和磷酸化位点分析Fig.2-14GlycosylationsitesandPhosphorylationsitesofPrrx1ainOryctolaguscuniculus使用NetNGlyc1.0工具分析发现Prrx1b蛋白具有5个糖基化位点，其中第2位（97NRTT）和第4位（132NLTE）的可能性最大。使用NetNGlyc2.0工具分析磷酸化位点，发现Prrx1b蛋白存在3个相关氨基酸的磷酸化位点。丝氨酸(Ser)有12个位点（21、35、56、63、67、72、86、167、192、197、201、203），酪氨酸(Tyr)有2个位点（118、190），苏氨酸(Thr)有3个位点（71、76、116），如图2-15。图2-15家兔Prrx1b蛋白质的糖基化位点和磷酸化位点分析Fig.2-15GlycosylationsitesandPhosphorylationsitesofPrrx1binOryctolaguscuniculus使用NetNGlyc1.0工具分析发现Prrx2蛋白具有4个糖基化位点，其中第1位（10NRTT）和第3位（45NLTE）的可能性最大。使用NetNGlyc2.0工具分析磷酸化位点，发现Prrx2蛋白存在3个相关氨基酸的磷酸化位点。丝氨酸(Ser)有9个位点（76、20 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱80、82、99、104、109、113、118、150），酪氨酸(Tyr)有3个位点（31、102、111），苏氨酸(Thr)有3个位点（29、115、126），如图2-16。图2-16家兔Prrx2蛋白质的糖基化位点和磷酸化位点分析Fig.2-16GlycosylationsitesandPhosphorylationsitesofPrrx2inOryctolaguscuniculusPrrx3蛋白具有2个糖基化位点，其中第1位（48NFTL）的可能性较大。使用NetNGlyc2.0工具分析磷酸化位点，发现Prrx3蛋白存在3个相关氨基酸的磷酸化位点。丝氨酸(Ser)有10个位点（7、12、19、45、76、114、183、188、203、204），酪氨酸(Tyr)有2个位点（66、124），1苏氨酸(Thr)有3个位点（16、64、199），如图2-17。图2-17家兔Prrx3蛋白质的糖基化位点和磷酸化位点分析Fig.2-17GlycosylationsitesandPhosphorylationsitesofPrrx3inOryctolaguscuniculus3.2.5蛋白质二级结构预测通过PBIL-IBCP网站的NetworkProteinSequenceAnalysis在线工具分析该Prrx1a蛋白的二级结构，可知该Prrx1a蛋白组成包括3个部分：α-螺旋区域(alphahelix)共56个氨基酸，占32.94%；无规则卷曲区域(randomcoil)共76个氨基酸，占44.71%；延伸链(extendedstrand)共38个氨基酸，占22.35%，如图2-18。21 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-18家兔Prrx1a蛋白质的二级结构预测Fig.2-18ResultofpredictivesecondarystructureofPrrx1aproteininOryctolaguscuniculus通过PBIL-IBCP网站的NetworkProteinSequenceAnalysis在线工具分析该Prrx1b蛋白的二级结构，可知该Prrx1b蛋白组成包括3个部分：α-螺旋区域(alphahelix)共106个氨基酸，占48.85%；无规则卷曲区域(randomcoil)共97个氨基酸，占44.70%；延伸链(extendedstrand)共14个氨基酸，占6.45%，如图2-19。图2-19家兔Prrx1b蛋白质的二级结构预测Fig.2-19ResultofpredictivesecondarystructureofPrrx1bproteininOryctolaguscuniculus通过PBIL-IBCP网站的NetworkProteinSequenceAnalysis在线工具分析该部分Prrx2蛋白的二级结构，可知该Prrx2蛋白组成包括3个部分：α-螺旋区域(alphahelix)共80个氨基酸，占51.28%；无规则卷曲区域(randomcoil)共66个氨基酸，占42.31%；延伸链(extendedstrand)共10个氨基酸，占6.41%，如图2-20。22 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-20家兔Prrx2蛋白质的二级结构预测Fig.2-20ResultofpredictivesecondarystructureofPrrx2proteininOryctolaguscuniculus通过PBIL-IBCP网站的NetworkProteinSequenceAnalysis在线工具分析该Prrx3蛋白的二级结构，可知该Prrx3蛋白组成包括3个部分：α-螺旋区域(alphahelix)共137个氨基酸，占61.99%；无规则卷曲区域(randomcoil)共74个氨基酸，占33.48%；延伸链(extendedstrand)共10个氨基酸，占4.52%，如图2-21。图2-21家兔Prrx3蛋白质的二级结构预测Fig.2-21ResultofpredictivesecondarystructureofPrrx3proteininOryctolaguscuniculus3.2.6蛋白质三级结构预测使用http://swissmodel.expasy.org/在线软件对Prrx1a蛋白的三级结构进行预测，选择Automatedmode(自动建模)。获得结果为92-156位氨基酸的预测结构，符合率为67.69%。结果如图2-22所示。23 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-22家兔Prrx1a蛋白的三级结构预测Fig.2-22TertiarystructureofPrrx1aproteininOryctolaguscuniculus使用http://swissmodel.expasy.org/在线软件对Prrx1b蛋白质的三级结构进行预测，选择Automatedmode(自动建模)。获得结果为92-156位氨基酸的预测结构，符合率为60.32%。结果如图2-23所示。图2-23家兔Prrx1b蛋白的三级结构预测Fig.2-23TertiarystructureofPrrx1bproteininOryctolaguscuniculus使用http://swissmodel.expasy.org/在线软件对Prrx2蛋白质的三级结构进行预测，选择Automatedmode(自动建模)。获得结果为4-70位氨基酸的预测结构，符合率为65.15%。结果如图2-24所示。24 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-24家兔Prrx2蛋白质的三级结构预测Fig.2-24TertiarystructureofPrrx2proteininOryctolaguscuniculus使用http://swissmodel.expasy.org/在线软件对Prrx3蛋白质的三级结构进行预测，选择Automatedmode(自动建模)。获得结果为40-105位氨基酸的预测结构，符合率为58.97%。结果如图2-25所示。图2-25家兔Prrx3蛋白的三级结构预测Fig.2-25TertiarystructureofPrrx3proteininOryctolaguscuniculus3.2.7蛋白质的B细胞抗原表位预测用BCEPRED预测该Prrx1a蛋白的B细胞抗原表位，通过多种方法分别预测比较可知，该Prrx1a蛋白最可能具有5个抗原表位的区域分别为54～60aa、67～76aa、81～98aa、162～169aa。结果如图2-26。1MTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVAAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFRRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYSAMATYSATCANNSPAQGINMANSIANLRLKAKEYSLQRNQVPTVN24525 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图2-26家兔Prrx1a蛋白的B细胞抗原表位分析Fig.2-26PredictionoflinearB-cellepitopesofPrrx1aproteininOryctolaguscuniculus用BCEPRED预测该Prrx1b蛋白的B细胞抗原表位，通过多种方法分别预测比较可知，该Prrx1b蛋白最可能具有6个抗原表位的区域分别为55～61aa、68～76aa、82～98aa、140～153aa、163～169aa、194～204aa。结果如图2-27。1MTSSYGHVLERQPALGGRLDSPGNLDTLQAKKNFSVSHLLDLEEAGDMVAAQADESVGEAGRSLLESPGLTSGSDTPQQDNDQLNSEEKKKRKQRRNRTTFNSSQLQALERVFERTHYPDAFVREDLARRVNLTEARVQVWFQNRRAKFRRNERAMLANKNASLLKSYSGDVTAVEQPIVPRPAPRPTDYLSWGTASPYRSSSLPRCCLHEGLHNGF217图2-27家兔Prrx1a蛋白的B细胞抗原表位分析Fig.2-27PredictionoflinearB-cellepitopesofPrrx1bproteininOryctolaguscuniculus用BCEPRED预测该Prrx3蛋白的B细胞抗原表位，通过多种方法分别预测比较可知，该Prrx3蛋白最可能具有4个抗原表位的区域分别为1～10aa、18～47aa、87～101aa、192～203aa。结果如图2-28。1MGAAERSREPGSPRLTEVSPELKDRKEDAKGMEDEGQTKIKQRRSRTNFTLEQLNELERLFDETHYPDAFMREELSQRLGLSEARVQVWFQNRRAKCRKQENQLHKGVLIGAASQFEACRVAPYVNVGALRMPFQQVQAQLQLDSAVAHAHHHLYPHLAAHAPYMMFPAPPFGLPLATLAADSASAASVVAAAAAAKTTSKNSSIADLRLKAKKHAAALGL221图2-28家兔Prrx3蛋白的B细胞抗原表位分析Fig.2-28PredictionoflinearB-cellepitopesofPrrx3proteininOryctolaguscuniculus4讨论真核生物基因的3’RACE克隆依赖于mRNA末端的PolyA结构，而且5’RACE克隆具有较大难度。Prrx2基因5’RACE末端克隆未获成功，不能完成对其5’末端进行分析。克隆得到Prrx3基因序列与敲除内含子预测序列（XM_008266391.1）相比第463位又C变成了T，但是改变的密码子不引起氨基酸序列的改变。Prrx3基因目前有较大争议，人的Shox2基因与小鼠Shox基因同源，但低于Shox2基因与OG12的同源性。Shox2与OG12编码的蛋白99%同源，而Shox与OG12编码的蛋白只有87%同源[17,18]。也就是说Shox2与小鼠Prrx3（之前被称为OG12）具有更高度的同源性，有可能是相同的基因。本研究的结果支持Prrx3（之前被称为OG12）与Shox2是相同基因。家兔Prrx3与人，小鼠，鼠兔的Prrx3氨基酸序列相比发现，家兔Prrx3氨26 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱基酸有相似的N端，而C端较短，各物种C端局部有较高的特异性。Prrx3蛋白的功能域位于C端，能够在成骨细胞系U20s表现为转录活性，但在P19细胞中却表现为抑制转录，N端未见明显活性[51]。在新西兰白兔胚胎克隆得到Prrx1b，在成年新西兰白兔克隆得到Prrx1a可能与Prrx1a、Prrx1b两种变异剪切体在不同的时期，表达量不同有关。Prrx1和Prrx2三级结构预测的结果较相近的主要原因可能是，两者的氨基酸序列大多相近，相似的三级结构模型中有与Prrx1和Prrx2保守区域类似的序列。对Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列的二级结构、三级结构和理化信息，以及疏水性的分析可以对该蛋白提供一个基础的认识。对Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列的糖基化和磷酸化位点以及B细胞抗原表位的分析可以提示该Prrx1a、Prrx1b和Prrx3蛋白的一些功能区域。所以，通过对Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列的生物学信息分析，可以为进一步的研究提供一定的参考。5小结5.1克隆的得到了Prrx1的两种变异剪切体，Prrx1a和Prrx1b，还克隆得到Prrx2和Prrx3。5.2比较了家兔和人，鼠兔，鼠的Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3的氨基酸同源性。5.3对家兔的Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3氨基酸序列进行了生物信息学分析，分析了各自的亲/疏水性、柔韧性、B细胞抗原表位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构和三级结构，对Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3的进一步研究提供了参考。27 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第三章Prrx基因家族的融合蛋白表达及WesternBlot分析同源异型框基因的同源异型框结构域包含的螺旋-转角-螺旋模序，通过识别将螺旋插入DNA大沟，氨基末端插入到相邻的小沟而结合DNA，这种特殊的结合使同源异型框蛋白能够激活或抑制下游基因的表达，从而实现其转录调控[1]。主要涉及胚胎发育和分化的基因调控事件[67]。许多同源异型框基因都涉及肢体结构和器官的发育，例如肢体、眼睛、脊髓和脑，通过有组织的计划和调控的定线方式。在生物制药，生命科学研究和生物制品的生产中，利用表达载体制备重组蛋白是重要而关键的环节。构建有效的表达载体，获得足够量的重组蛋白是进行深入研究和应用的必要条件。同时也是表达目的基因的基本要求和影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。本研究构建pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3表达载体，转化到BL21感受态细胞进行融合蛋白表达，优化了表达条件，纯化了蛋白，并进行Westernblot检验融合蛋白的抗原活性。1材料1.1主要试剂第二章2.3.3中阳性的质粒载体pMD19-T-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3。鼠抗人Prrx2[26](Abnova，台湾)；HRP标记的羊抗鼠IgG（北京中杉金桥，中国）；pET-32(a(+))载体由本实验室保存。XhoⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶、D2000DNAMarker、T4DNA连接酶均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；1kbLadderDNAmarker、DNAmarkerⅠ、BL21感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。ECL显色液（上海博谷生物，中国）。HistrapTMHP纯化柱（GE，美国）。蛋白电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；凝胶成像系统VerSaDoc2000（Bio-Rad，美国）。其他试剂见第二章1.2和1.3。1.2相关缓冲液配制PBS缓冲液（pH7.4）：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，调pH至7.4，最后定容至1L。高温高压灭菌后4℃保存备用。10%SDS：称取10g十二烷基硫酸钠粉末，将其溶解于100mL去离子水中，室温保存。28 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29.2g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g，完全溶解后定容至100mL，再用0.25μm细菌过滤器过滤，棕色瓶内4℃保存。5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：甘氨酸（电泳级）94g，Tris碱15.1g，SDS5.0g，调节pH为8.3，用去离子水定容至1000mL，常温储存。SDS-PAGE电泳时稀释成1×使用。Tris-HCl(pH8.8，1.5mol/L)：将Tris碱18.15g溶于80mL的去离子水中，pH调至8.8，去离子水定容至100mL，4℃保存。10%过硫酸铵(w/v)：1mL去离子水中加入过硫酸铵0.1g，溶解混匀，于－20℃储存，现配现用。5×SDS凝胶上样缓冲液：溴酚蓝25mg，0.5gSDS固体粉末，甘油2.5mL，1mmol/LTris-HCl(pH6.8)加入去离子水溶解定容至5mL。分装为每份500μL，使用前加入25μLβ-巯基乙醇。－20℃保存备用。12%分离胶的配制（20mL）：Tris-HCl5.0mL(pH=8.8)，10%SDS0.18mL，30%丙烯酰胺混合液8.0mL，10%过硫酸铵（w/v）0.2mL，ddH2O6.6mL，TEMED8μL。5%浓缩胶的配制（1mL，1块胶）：30%丙烯酰胺混合液0.17mL，ddH2O0.68mL，1mmol/LTris-HCl(pH=6.8)0.13mL，10%SDS(w/v)10μL，10%过硫酸铵（w/v）10μL，TEMED1μL。考马斯亮蓝R-250染色液配制：125mL无水乙醇，0.5g考马斯亮蓝R-250，25mL冰醋酸，用去离子水定容至250mL，过滤后常温保存。脱色液：称取9.3gKCl溶于500mL去离子水中。TBS缓冲液：NaCl8.0g，Tris碱2.4g，pH调至7.5，定容至1000mL备用。TBST：现用现配。1000mLTBS溶液中加入0.5mLTween20，混匀。封闭液：现用现配。在100mLTBS溶液中加入5.0g脱脂奶粉，混匀。蛋白电转缓冲液：5.8gTris碱，2.9g甘氨酸，0.37gSDS，200mL甲醇，去离子水定容至1000mL，常温保存。50×TAE储液：51.7mL冰醋酸，242gTris碱，0.5mol/L的EDTA(pH8.0)100mL，加水定容至1L，于室温保存，使用时稀释成1×使用。29 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱2方法2.1重组表达载体的构建将鉴定阳性的PMD19-T-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3质粒，和pET32a(+)质粒分别经过BamhⅠ和XholⅠ限制性内切酶双酶切。37℃酶切，3h。酶切体系如下：表3-1酶切体系Table3-1Digestionsysterm试剂体积（μL）RegentVolume10×BufferK2质粒10BamHⅠ2XhoⅠ2ddH2O4酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，100V，80mA，60min。酶切产物用小片段DNA纯化试剂盒纯化回收。将纯化后的目的片段，pET-32a(+)载体片段用T4DNA连接酶连接，16℃连接12h，转化进入DH5α大肠杆菌。连接体系见表3-2：表3-2T4连接酶连接体系Table3-2T4Ligasesysterm试剂体积（μL）RegentVolume10×Buffer1DNA6pET-32a(+)质粒2T4DNALigse1将连接产物转化进DH5α感受态大肠杆菌，并涂布于含有AMP、IPTG和X-Gal的LB平板。经过PCR和双酶切鉴定的阳性克隆由上海生工生物工程测序验证，命名为pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3。2.2融合蛋白的诱导表达提取pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3质粒，转化进入BL21(DE3)。转化方法同DH5α大肠杆菌。筛选出阳性菌落由IPTG诱导表达，产生TrxA-His-tag融合蛋白。菌液接种于含有AMP的液体LB培养基中，200r/min摇床振荡，37℃，培养2～3h，至OD600达到0.6后，分别取2mL菌液作为诱导前的对照，其余菌液加入IPTG(1mol/L)，使终浓度为1.0mmol/L，37℃，180r/min摇床诱导培养，取2h，4h，6h，30 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱8h及过夜后分别收取菌液2mL，8000r/min离心20min收集菌体沉淀，加入200μLPBS（0.15mol/L，pH=7.4）重悬。优化IPTG诱导的浓度和温度。2.3表达产物的SDS-PAGE检测组装好电泳装置。加入12%分离胶和浓缩胶。将收集的菌体沉淀重悬于200μL的PBS缓冲液，加入5μL的5×SDS凝胶上样缓冲液，吹打均匀，沸水浴5min。短暂离心，每孔上样10μL，进行SDS-PAGE电泳。80V，30min，120V，1h～1.5h。电泳停止后取出凝胶，考马斯亮蓝染料中染色1h。将凝胶置于脱色液脱色，直至出现清晰条带，用凝胶成像系统采集保存图像。表达出的蛋白命名为Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白。2.4重组蛋白的纯化根据SDS-PAGE的结果，选择表达量最高的时间点，IPTG诱导浓度和温度，诱导表达100mL菌液。将诱导后的菌液8000r/min离心20min收集菌体沉淀，用适量10mLPBS洗涤两次，并重悬。在冰浴条件下进行超声破裂，300W，工作5s，间隔9s，破碎20min，直至菌体悬浮液由浑浊粘稠变为透亮透明。菌液8000r/min离心20min，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测。按照包涵体的处理方法，使用HistrapTMHP纯化柱进行纯化（流速：10倍柱体积/小时）。使用15倍柱体积的Binding缓冲液冲洗柱子，收集流穿峰。使用5倍柱体积的Elution缓冲液洗脱，收集洗脱峰。3倍柱体积的Binding缓冲液和5倍柱体积的去离子水依次洗涤后，用3倍柱体积的20%乙醇溶液平衡，4℃保存。2.5重组蛋白的WesternBlot检测（1）半干转印：此次将融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，注意样品应在70℃水浴5min，不要煮沸处理。其他电泳步骤按照本章2.3操作。电泳结束后，将凝胶，滤纸放入电转液中平衡30min。将与凝胶大小一致的PVDF膜依次在如下溶液中进行浸润处理：甲醇，10s；去离子水，5min；电转液，10min。组装好电泳装置。依次按照，滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序从下向上放置，进行电泳。其间应对齐，没有气泡。恒压12V，电转0.5～2h。（2）封闭：将电转好的PVDF膜浸泡在封闭液中，4℃孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min。31 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱（3）一抗结合：用1：500稀释的鼠抗人Prrx2IgG与PVDF膜在室温孵育2h。TBST洗涤5次，每次10min。（4）酶标二抗结合：用1：2000稀释的HRP标记的绵羊抗鼠IgG作为二抗室温孵育2h。TBST洗涤5次。（5）底物显色：按ECL试剂盒说明书进行。PVDF膜在10mL底物液中浸泡1～10min，在蛋白条带出现后，去离子水终止显色，在VersaDoc2000成像系统下观察显色。3结果3.1pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒的双酶切鉴定结果将回收纯化后的目的基因片段克隆到原核表达载体pET32a(+)上，构建原核表达重组质粒。重组质粒pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3在BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，分别在5900，738bp；5900，654bp；5900，471bp；5900，666bp处出现条带，与预期结果相一致。说明原核表达载体构建成功。结果如图3-1。abcd图3-1pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒的双酶切鉴定Fig.3-1DoubleenzymedigestionrusultofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3a1pET32a(+)-Prrx1a重组质粒,2pET32a(+)-Prrx1a重组质粒双酶切结果;b1pET32a(+)-Prrx1b重组质粒,2pET32a(+)-Prrx1b重组质粒双酶切结果;c1pET32a(+)-Prrx2重组质粒,2pET32a(+)-Prrx2重组质粒双酶切结果;d1pET32a(+)-Prrx3重组质粒,2pET32a(+)-Prrx3重组质粒双酶切结果.a1recombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1a,2DoubleenzymedigestionrusultofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1a;b1recombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1b,2DoubleenzymedigestionrusultofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1b;c1recombinantplasmidspET32a(+)-Prrx2,2DoubleenzymedigestionrusultofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx2;d1recombinantplasmidspET32a(+)-Prrx3,2DoubleenzymedigestionrusultofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx3.32 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱3.2表达产物的SDS-PAGE检测3.2.1不同的诱导时间点对pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒表达表达量的影响SDS-PAGE分析结果表明，pET32a(+)-Prrx1a的在BL21细胞中能够表达44kDa左右大小的特异蛋白条带，蛋白的大小与预期相符合。当IPTG浓度为1.0mM，重组表达工程菌在开始诱导2h即可表达目的蛋白，在诱导6h时表达量最高，结果如图3-2。图3-2优化重组质粒pET32a(+)-Prrx1a在BL21中的诱导表达时间Fig.3-2OptimizeinducibleexpressiontimeofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1ainBL211:空载诱导前;2:空载诱导后;3-8:分别诱导了0、2、4、6、8h和过夜的重组质粒表达产物1:Vectorexpressionwithoutinduction;2:VectorexpressioninducedwithIPTGovernight;3-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx1aexpressedproductinE.coliBL21inducedwithIPTGat0,2,4,6,8hoursandovernighttimepointSDS-PGE分析结果表明，pET32a(+)-Prrx1b的在BL21细胞中能够表达41kDa左右大小的特异蛋白条带，蛋白的大小与预期相符合。当IPTG浓度为1mM，重组表达工程菌在开始诱导2h即可表达目的蛋白，在诱导6h时表达量最高，结果如图3-3。33 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图3-3优化重组质粒pET32a(+)-Prrx1b在BL21中的诱导表达时间Fig.3-3OptimizeinducibleexpressiontimeofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1binBL211:空载诱导前;2:空载诱导后;3-8:分别诱导了0、2、4、6、8h和过夜的重组质粒表达产物1:Vectorexpressionwithoutinduction;2:VectorexpressioninducedwithIPTGovernight;3-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx1bexpressedproductinE.coliBL21inducedwithIPTGat0,2,4,6,8hoursandovernighttimepointSDS-PAGE分析结果表明，pET32a(+)-Prrx2的在BL21细胞中能够表达34kDa左右大小的特异蛋白条带，蛋白的大小与预期相符合。当IPTG浓度为1mM，重组表达工程菌在开始诱导2h即可表达目的蛋白，在诱导6h时表达量最高，结果如图3-4。图3-4优化重组质粒pET32a(+)-Prrx2在BL21中的诱导表达时间Fig.3-4OptimizeinducibleexpressiontimeofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx2inBL211:空载诱导前;2:空载诱导后;3-8:分别诱导了0、2、4、6、8h和过夜的重组质粒表达产物1:Vectorexpressionwithoutinduction;2:VectorexpressioninducedwithIPTGovernight;3-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx2expressedproductinE.coliBL21inducedwithIPTGat0,2,4,6,8hoursandovernighttimepointSDS-PAGE分析结果表明，pET32a(+)-Prrx3的在BL21细胞中能够表达41kDa左右大小的特异蛋白条带，蛋白的大小与预期相符合。当IPTG浓度为1mM，重组表达工程菌在开始诱导2h即可表达目的蛋白，在诱导过夜时表达量最高，结果如图3-5。34 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图3-5优化重组质粒pET32a(+)-Prrx3在BL21中的诱导表达时间Fig.3-5OptimizeinducibleexpressiontimeofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx3inBL211:空载诱导前;2:空载诱导后;3-8:分别诱导了0、2、4、6、8h和过夜的重组质粒表达产物1:Vectorexpressionwithoutinduction;2:VectorexpressioninducedwithIPTGovernight;3-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx3expressedproductinE.coliBL21inducedwithIPTGat0,2,4,6,8hoursandovernighttimepoint3.2.2不同的IPTG诱导浓度对pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒表达量的影响在同样的诱导时间条件下，改变IPTG诱导浓度（0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM）对pET32a(+)-Prrx1a进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当IPTG浓度为1.0mM时，pET32a(+)-Prrx1a的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-6。图3-6优化重组质粒pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b在BL21中的IPTG诱导浓度Fig.3-6OptimizeIPTGconcentrationofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1a/Prrx1binBL211-4:分别使用0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/L的IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx1a的表达产物;5-8:分别使用0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/L的IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx1b的表达产物;1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx1aexpressedproductinE.coliBL21inducedwith0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/LIPTG;5-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx1bexpressedproductinE.coliBL21inducedwith0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/LIPTG在同样的诱导时间条件下，改变IPTG诱导浓度（0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM）进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当IPTG浓度为1.0mM时，pET32a(+)-Prrx1b的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-6。在同样的诱导时间条件下，改变IPTG诱导浓度（0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM）对pET32a(+)-Prrx2表达进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当IPTG浓度为1.0mM时，pET32a(+)-Prrx2的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-7。35 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图3-7优化融合质粒pET32a(+)-Prrx2在BL21中的IPTG诱导浓度Fig.3-7OptimizeIPTGconcentrationofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx2inBL211-4:分别使用0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/L的IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx2的表达产物1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx2expressedproductinE.coliBL21inducedwith0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/LIPTG在同样的诱导时间条件下，改变IPTG诱导浓度（0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM）对pET32a(+)-Prrx3表达进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当IPTG浓度为1.0mM时，pET32a(+)-Prrx3的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-8。图3-8优化融合质粒pET32a(+)-Prrx3在BL21中的IPTG诱导浓度Fig.3-8OptimizeIPTGconcentrationofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx3inBL211-4:分别使用0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/L的IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx3的表达产物1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx3expressedproductinE.coliBL21inducedwith0.4mol/L,0.6mol/L,0.8mol/L,1.0mol/LIPTG3.2.3不同的诱导温度对表达量的影响对pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒表达量的影响在同样的诱导时间和IPTG诱导浓度条件下，改变诱导温度（25℃、28℃、30℃、37℃）对pET32a(+)-Prrx1a进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当温度为37℃时，pET32a(+)-Prrx1a的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-9。36 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图3-9优化融合质粒pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b在BL21中的诱导表达温度Fig.3-9OptimizeinducibleexpressiontemperatureofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1aandpET32a(+)-Prrx1binBL211-4:分别在37℃,30℃,28℃和25℃诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx1a的表达产物;5-8:分别在37℃,30℃,28℃和25℃诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx1b的表达产物1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx1aexpressedproductinE.coliBL21inducedunder37℃,30℃,28℃and25℃;5-8:RecombinantpET32a(+)-Prrx1bexpressedproductinE.coliBL21inducedwithunder37℃,30℃,28℃and25℃.在同样的诱导时间和IPTG诱导浓度条件下，改变诱导温度（25℃、28℃、30℃，37℃）对pET32a(+)-Prrx1b进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当温度为37℃时，pET32a(+)-Prrx1b的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-9。在同样的诱导时间和IPTG诱导浓度条件下，改变诱导温度（25℃、28℃、30℃、37℃）对pET32a(+)-Prrx2进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当温度为37℃时，pET32a(+)-Prrx2的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-10。图3-10优化融合质粒pET32a(+)-Prrx2在BL21中的诱导表达温度Fig.3-10OptimizeinducibleexpressiontemperatureofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx2inBL211-4:分别在37℃,30℃,28℃和25℃诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx2的表达产物1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx2expressedproductinE.coliBL21under37℃,30℃,28℃and25℃37 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱在同样的诱导时间和IPTG诱导浓度条件下，改变诱导温度（25℃、28℃、30℃、37℃）对pET32a(+)-Prrx3进行优化，SDS-PAGE分析结果表明，当温度为37℃时，pET32a(+)-Prrx3的在BL21细胞中的表达量最高，结果如图3-11。图3-11优化融合质粒pET32a(+)-Prrx3在BL21中的诱导表达温度Fig.3-11OptimizeinducibleexpressiontemperatureofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx3inBL211-4:分别在37℃、30℃、28℃和25℃诱导重组质粒pET32a(+)-Prrx3的表达产物1-4:RecombinantpET32a(+)-Prrx3expressedproductinE.coliBL21under37℃,30℃,28℃and25℃3.3纯化重组蛋白经过超声破碎离心后的上清及菌体沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示，pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组蛋白均主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中，结果如图3-12。图3-12pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒菌液的超声破碎Fig.3-12UltrasonicationofrecombinantplasmidspET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3inBL211:pET32a(+)-Prrx1a重组质粒菌液破碎后上清;2:pET32a(+)-Prrx1a重组质粒菌液破碎后沉淀;3:pET32a(+)-Prrx1b重组质粒菌液破碎后上清;4:pET32a(+)-Prrx1b重组质粒菌液破碎后沉淀;5:pET32a(+)-Prrx2重组质粒菌液破碎后上清;6:pET32a(+)-Prrx2重组质粒菌液破碎后沉淀;7:pET32a(+)-Prrx3重组质粒菌液破碎后上清;8:pET32a(+)-Prrx3重组质粒菌液破碎后沉淀。1:supernatantofrecombinantpET32a(+)-Prrx1aexpressingproduct;2:precipitateofrecombinantpET32a(+)-Prrx1aexpressingproduct;3:supernatantofrecombinantpET32a(+)-Prrx1bexpressingproduct;4:precipitateofrecombinantpET32a(+)-Prrx1bexpressingproduct;5:supernatantofrecombinantpET32a(+)-Prrx2expressingproduct;6:precipitate38 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱ofrecombinantpET32a(+)-Prrx2expressingproduct;7:supernatantofrecombinantpET32a(+)-Prrx3expressingproduct;8:precipitateofrecombinantpET32a(+)-Prrx3expressingproduct.将上清中的融合蛋白，按照可溶性蛋白的纯化方法纯化重组蛋白使用HistrapTMHP纯化柱进行纯化。结果如图3-13。图3-13pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组蛋白的纯化Fig.3-13PurificationofrecombinantproteinpET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx31pET32a(+)质粒;2pET32a(+)-Prrx1a;3pET32a(+)-Prrx1b;4pET32a(+)-Prrx2;5pET32a(+)-Prrx31pET32a(+)plasmid;2pET32a(+)-Prrx1a;3pET32a(+)-Prrx1b;4pET32a(+)-Prrx2;5pET32a(+)-Prrx33.4Westernblot检测结果按ECL试剂盒说明书进行Westernblot结果检测。PVDF膜在10mL底物液中浸泡显色，在去离子水终止中显色，在VersaDoc2000成像系统下观察显色。结果如图3-14。图3-14pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组蛋白的Westernblot分析Fig.3-14WesternblotresultofrecombinantproteinpET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3M1pET32a(+)-Prrx1a;2pET32a(+)-Prrx1b;3pET32a(+)-Prrx2;4pET32a(+)-Prrx3;5pET32a(+)plasmid39 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱3.5pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3的质粒图谱使用DNAMAN软件，制作pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3重组质粒的物理图谱，标注Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3基因在质粒中的位置。结果如图3-15至图3-18所示。Xho(158)ⅠBamHⅠ(896)Bpu1102(80)EcoR(904)ⅤNco(910)Ⅰ1f1origin(6131-6887)KpnⅠ(936)Prrx1aBglⅡ(939)Ap(5143-6000)Nsp(966)ⅤTrxA(1064-1390)MscⅠ(1049)pET32a(+)-Prrx1aXba(1427)ⅠSgrA(1538)6598bpSph(1694)ⅠAlwN(4736)Ori(4382)EcoN(1754)lac1(1869-2948)BspLUⅠ(4320)Sap(4204)ⅠBst1107(4091)Tth111(4065)PshAⅠ(3064)BspGⅠ(3846)Pmp5Ⅱ(3326)图3-15pET32a(+)-Prrx1a重组质粒的物理图谱Fig.3-15ThefeaturemapofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1aBpu1102Ⅰ(80)SapⅠ(6120)XhoⅠ(158)EcoRⅤ(637)1f1origin(6047-6504)BglⅡ(672)Prrx1b(812-158)KpnⅠ(852)Ap(5059-5916)NcoⅠ(826)TrxA(980-1306)BamHⅠ(812)pET32a(+)-Prrx1bNspⅤ(882)MscⅠ(965)6514bpXbaⅠ(1343)AlwNⅠ(4652)ori(4298)SgrAⅠ(1610)EcoNⅠ(1670)lacl(1785-2864)BspLU11Ⅰ(4236)Bst1107Ⅰ(4007)Tth111Ⅰ(3981)Psp5(3065)PshAⅠ(2980)BspGⅠ(3762)图3-16pET32a(+)-Prrx1b重组质粒的物理图谱40 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱Fig.3-16ThefeaturemapofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx1bBamHⅠ(629)XhoⅠ(158)Bpu1102Ⅰ(80)EcoRⅤ(637)NcoⅠ(643)BglⅡ(672)1f1origin(5865-6317)KpnⅠ(669)Prrx2(158-629)NspⅤ(699)Ap(4876-5733)TrxA(797-1123)Msc(782)pET32a(+)-Prrx2XbaⅠ(1160)SgrAⅠ(1271)6331bpSphⅠ(1427)ori(4115)EcoNⅠ(1481)AlwNⅠ(4469)lacl(1602-2681)BspLU11Ⅰ（4053）SapⅠ(3937)PshAⅠ(2797)Bst1107Ⅰ（3824）PspⅡ(3059)Tth111Ⅰ(3798)BspGⅠ（3579）图3-16pET32a(+)-Prrx2重组质粒的物理图谱Fig.3-16ThefeaturemapofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx2XhoⅠ(158)EagⅠ(166)NotⅠ(166)HindⅢ(173)1SalⅠ(179)florigin(6094-6541)SacⅠ(190)EcoRⅠ(192)Prrx3(192-858)BamHⅠ(858)Ap(5105-5962)TrxA(1026-1352)EcoRⅤ(866)pET32a(+)-Prrx3NcoⅠ(872)KpnⅠ(898)BglⅡ(901)6560bpNspⅤ(928)ori(4344)MscⅠ(1011)lacl(1831-2910)XbaⅠ(1389)Bst1107Ⅰ(1507)SgrAⅠ(1500)SphⅠ(1656)AlwNⅠ(4698)EcoNⅠ(1716)BspLU11Ⅰ(4282)PshAⅠ(3026)SapⅠ(4166)Tth111Ⅰ(4027)Psp5Ⅱ(3288)BspGⅠ(3808)图3-16pET32a(+)-Prrx3重组质粒的物理图谱Fig.3-16ThefeaturemapofrecombinantplasmidpET32a(+)-Prrx341 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱4讨论本实验选择了pET32a(+)载体蛋白表达系统在原核细胞大肠杆菌中对Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3的氨基酸序列进行了表达。在进行外源基因的原核表达pET32a(+)载体中，若插入基因片段较长，则蛋白多以包涵体的形式出现。并且蛋白表达过快，使蛋白来不及正确加工折叠，常需要溶解复性，且杂蛋白较多。本研究还在pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白表达的诱导条件方面进行了探究。当诱导时间为分别为6h、6h、6h和过夜时，pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白的表达量最高。当加入IPTG浓度由0.4mM、0.6mM、08mM、1.0mM递增，融合蛋白表达量也随之递增。但当IPTG达到1.0mM时，融合蛋白表达量已经接近上限。之后IPTG浓度增加对融合蛋白表达量影响不大。诱导温度梯度为25℃、28℃、30℃、37℃、在37℃获得最高的表达量。有文献报道称，低温诱导能够促进融合蛋白的表达。本研究发现最适温度下（37℃）的诱导量才最大，而低温影响了融合蛋白的表达，可能的原因是，低温降低了酶活性，影响了细菌的生长繁殖和其他生命活动[66]。鼠抗人Prrx2能够识别pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白，是因为同源异型框基因有高度保守的同源异型框结构域，有相似的抗原表位。在进行Westernblot检测时，注意在SDS-PAGE检测前不应煮沸菌体，以免破坏蛋白的结构，改变原本的抗原表位。5小结5.1本研究构建了pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合质粒，并转化进入BL21细胞进行表达。5.2对pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合质粒进行优化表达，确定最佳诱导条件。并对菌液进行破碎离心，确定融合蛋白都在上清中，说明融合蛋白是分泌蛋白。5.3对pET32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白进行Westernblot分析，确定了融合蛋白的抗原性。42 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第四章家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析实时定量PCR是基于荧光信号，用于定量基因的转录水平，了解基因的表达量和功能的技术。它是研究基因差异表达最常用的技术，具有特异、灵敏、快速和高通量等优点，在生命科学研究中被广泛应用。在某一点cDNA扩增产生的可接受荧光信号转化成cyclethreshold(Ct)，take-offpoint(TOP)或者quantificationcyclenumber(Cq)[69,70]。在相对定量检测中，对来自不同样本中特定基因的mRNA表达量水平进行比较分析时，理想的条件是用于制备RNA的各样品起始细胞数相同，RNA的提取效率及反转录效率相同。但实际上这些条件不可能同时得到满足，许多因素可能导致测量不一致，例如测量的组织细胞的不同的数量和类型、RNA提取效率、mRNA处理技术[71]、mRNA完整性、反转录的方法和效率、分析检测方法[72]等。为了确定结果的准确性和特异性，和准确标准化必须控制这些因素[73]。内参基因是一种维持细胞最低限度功能不可缺少的基因。理想的内参基因在不同类型细胞和组织中的表达应无显著差异，且不受试验和临床条件的影响。由于内参基因的表达具有物种及组织特异性，所以其表达的稳定性是相对的。为了获得有意义的试验数据，研究者根据自己特殊的组织及试验条件来选择合适的内参基因[74,75]。2009年[71,76]，RT-PCR试验最低要求试验信息量(MinimumInformationforPublicationofQuantitativeReal-timePCRExperiments，MIQE)的发表给所有RT-PCR数据报道确定了一个准则。这个指南的应用确保发表RT-PCR数据更为详细（包括关键参数例如RNA完整度，RT-PCR质量控制和反应效率），同时确定了候选内参基因的重要性。本研究按照MIQE的指导，检测在胚胎期，幼龄期，成年期三个阶段的新西兰白家兔的3个器官（肾、心、肝）中6个常用的内参基因（GAPDH、HPRT1、18SrRNA、Beta-2-microglobulin、Sdha、β-actin）的稳定性[77]。使用最新的内参基因稳定性在线评价软件RefFinder[78](http://www.leonxie.com/referencegene.php)确定最适合的内参基因，即受年龄发育状态影响和不同组织影响最小的基因。RefFinder基于四种常用算法（geNorm、BestKeeper、NormFinder和comparativedelta-CT）的几何平均数的指定权重法来排列基因的稳定性[79-82]。43 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱1材料试验所有组织来自9只新西兰白兔。分为胚胎期（E28.5d）、幼龄期（出生后10d）、成年期3组，每组3只。每只采集肾、心、肝组织3份，置于-80℃低温冰箱保存备用。其他试剂见第二章1.2和1.3。2方法2.1总RNA提取和cDNA合成肾、心、肝50mg剪碎后加入1mLRNAisoReagent（TaKaRa，大连，中国），进行总RNA提取。获得的RNA用50μLDEPC水稀释，-80℃保存。使用分光光度计（BioSpec-nano，日本）测定RNA的浓度和质量。并用琼脂糖凝胶电泳测定28S/18S核糖体RNA的比值对RNA完整度进行评估。所有的RNA样品的OD260/OD280比值都在1.7～2.0之间，而且RNA的完整度较高。cDNA的合成按RTReagents试剂盒（TaKaRa，日本）说明书进行。获得的cDNA10倍稀释，置于-80℃保存。2.2引物的特异性鉴定及阳性标准品的制备引物[83]（Table4-1）由生工生物工程合成（上海，中国）。使用cDNA作为模板进行PCR，扩增6个内参基因的目的片段，反应条件为95℃，5min，变性95℃，40S，退火60℃，40S，延伸72℃，30S，72℃总延伸10min，16℃结束反应。循环数为30个。总PCR反应体系为25μL：Mix（TaKaRa，大连，中国）12.5μL，上下游引物各1μL（10μmol/mL），cDNA2μL，ddH2O8.5μL。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳使用100V，80mA，30min。使用DNA胶回收试剂盒（Axygen，美国）回收目的片段，溶于20μLddH2O。与pMD19-TVector质粒载体（TAKARA，日本）连接。连接体系为SolutionⅠ5μL，DNA4μL，PMD19-TVector1μL，时间为1h。转化大肠杆菌DH5α（TAKARA，大连，中国）。提取质粒（Axygen，美国），送生工生物工程进行测序验证（上海，中国）。质粒浓度测定基于全质粒，用分光光度计测量浓度（BioSpec-nano，日本），作为阳性标准品。10倍梯度稀释阳性质粒，采用10-2至10-87个浓度梯度构建标准曲线。44 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱表4-16个候选内参基因的引物Table4-1Primersforsixcandidatereferencegenes基因登录号长度引物序列(5'～3')质粒浓度检测下限GeneAccessionconcentrationLowerlimitlength(bp)Primersequences(5'-3')namenumber（ng/μl）(copies)F4:TGGTGAAGGTCGGAGTGAACGAPDHNM_00108225312140.1313.00R4:ATGTAGTGGAGGTCAATGAATGGF5:CCTTGGTCAAGCAGTATAATCHPRT1NM_00110567113538.3612.38R5:GGGCATATCCTACAACAAACF6:ATCAGATACCGTCGTAGTTC18SrRNANR_033238.116711.9838.21R6:TTCCGTCAATTCCTTTAAGF7:AACGTGGAACAGTCAGACCB2MXM_002717921.115738.1512.21R7:AGTAATCTCGATCCCATTTCF8:GGACCAGGACGCCATCCACTACSdhaXM_00272319412434.541.12R8:TCCACCGAACGCACGCTGATAGF9:CAAGCGTGGCATCCTGACActbNM_00110168310037.1812.14R9:CTCGTTGTAGAAGGTGTGGTG2.3RT-PCR扩增使用CFX96（BioRad，美国）荧光定理PCR仪进行两步法扩增。每个阶段的家兔组织都有3个生物学重复，每个样品中各内参基因都进行3次PT-qPCR扩增，分别得出各样本的各内参基因Ct值。qPCR前先使用梯度PCR确定最佳退火温度。10倍梯度稀释阳性标准品，确定各基因的扩增率和最低检测下限。qPCR反应使用20μL反应体系，SYBRGreenⅡ（TAKARA，日本）10μL，上下游引物0.4μL，ddH2O7.2μL，cDNA2μL。qPCR反应条件为95℃，3min，95℃，15s，60℃，30s，循环数为40个。溶解曲线为55℃到95℃，每15S增加0.5℃，用以确定扩增特异性。2.4表达数据分析通过CFXManager软件获得各样本的原始数据，输入Excel进一步分析。用RefFinder分析所有基因的稳定性。3结果3.1内参基因引物的特异性GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha和β-actin6个基因PCR的扩增产物进行2%的琼脂糖电泳（Figure4-1）。6对引物特异性较好，均无引物二聚体，胶回收产物及克隆测序结果均与目的基因序列完全一致，能够满足试验需要。45 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图4-1目的片段的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4-1AgarosegelelectrophoresisoftargetproductsNote:M6001GAPDH2HPRT1318SrRNA4B2M5Sdha6β-actin3.2各基因的扩增曲线和溶解曲线使用CFX96（BioRad，美国）荧光定理PCR仪对GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha和β-actin6个内参基因进行两步法RT-PCR的扩增。获得各基因的扩增曲线及溶解曲线。如图所示，RT-PCR产物只有一个特异峰，无非特异性扩增峰和无引物二聚体。GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha和β-actin6个内参基因的溶解温度分别为（84.75±0.25）、（82.25±0.25）、86.50、（82.25±0.25）、84.00、（84.75±0.25）。aGAPDH扩增曲线及溶解峰aAmplificationandmeltpeakofGAPDHbHPRT1扩增曲线及溶解峰bAmplificationandmeltpeakofHPRT146 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱c18SrRNA扩增曲线及溶解峰cAmplificationandmeltpeakof18SrRNAdB2M扩增曲线及溶解峰dAmplificationandmeltpeakofB2MeSdha扩增曲线及溶解峰eAmplificationandmeltpeakofSdha47 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱fβ-actin扩增曲线及溶解峰fAmplificationandmeltpeakofβ-actin图4-2内参基因的扩展曲线和溶解峰Fig.4-2Amplificationandmeltpeakofreferencgenes3.3阳性标准品的制备及标准曲线的构建采用分光光度计测定质粒OD260/OD280，计算质粒浓度和检测下限（Table4-1）。将10倍梯度稀释的标准品作为模板，进行RT-PCR扩增。以获得的Ct值为纵坐标，拷贝数对数值LogCO为纵坐标做线性回归曲线。由图4-3、图4-4可知，各基因在系列稀释梯度内有良好的线性关系。图4-318SrRNA、B2M和β-actin的标准曲线Fig.4-3StandardcurveofGAPDH,HPRT1andSdha图4-4GAPDH、HPRT1和Sdha的标准曲线Fig.4-4StandardcurveofGAPDH,HPRT1andSdha3.4内参基因在各组织不同时期的表达稳定性通过对各组织中6个内参基因的表达稳定性分析发现，肾和肝中最稳定的三个内参基因依次是β-actin、HPRT1和GAPDH（图4-5），而在心组织中最稳定的三个内参基因依次β-actin、HPRT1和Sdha。在心和肝中，18SrRNA是最不稳定的内参基因，48 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱但在肾中，最不稳定的内参基因是B2M。a家兔心的合适内参基因分析aExpressionstabilityofreferencegenesindifferentdevelopmentperiodsofOryctolaguscuniculusheartb家兔肾的合适内参基因分析bExpressionstabilityofreferencegenesindifferentdevelopmentperiodsofOryctolaguscuniculuskidneyc家兔肝的合适内参基因分析cExpressionstabilityofreferencegenesindifferentdevelopmentperiodsofOryctolaguscuniculusliver图4-5内参基因在各组织不同时期的表达稳定性Fig.4-5ExpressionstabilityofreferencegenesindifferentdevelopmentperiodsofOryctolaguscuniculustissues3.5内参基因在各时期不同组织的表达稳定性在家兔的胚胎期的心、肝和肺组织中，最稳定的三个内参基因依次是GAPDH、β-actin和HPRT1（图4-6）。而在幼龄期和成年期，最稳定的三个内参基因依次是HPRT1、GAPDH和β-actin。B2M是胚胎期和幼龄期最不稳定的内参基因，18SrRNA49 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱是成年期最不稳定的内参基因。a家兔胚胎期合适内参基因分析aExpressionstabilityofreferencegenesinOryctolaguscuniculustissuesofembryonicperiodb家兔幼龄期合适内参基因分析bExpressionstabilityofreferencegenesinOryctolaguscuniculustissuesofjuvenileperiodc家兔成年期合适内参基因分析cExpressionstabilityofreferencegenesinOryctolaguscuniculustissuesofjuvenileadultperiod图4-6内参基因同时期不同组织的表达稳定性Fig.4-6ExpressionstabilityofreferencegenesinOryctolaguscuniculustissuesofdifferentdevelopmentperiods3.6内参基因在不同时期不同组织的表达稳定性分析家兔3个发育阶段和3种组织的内参基因稳定性结果表明，表达最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1和GAPDH，而18SrRNA显示最差的稳定性，见图4-7。50 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图4-7内参基因在不同时期不同组织的表达稳定性Fig.4-7RefFinderanalysiscomparingtheselectedreferencegenesforalltimingsandalltissues4讨论已经证实，由于内参基因标准化过程中的夸大和缩小效应，微小的差异很难通过RT-PCR来定量[79]。内参基因的稳定表达对RT-PCR的标准化是很重要的，但目前并没有发现一个内参基因在所有细胞、组织、时期，或在不同的试验处理下都能够稳定地表达[84]。在某个组织或时期表达最稳定的内参基因在其他组织或时期的表达可能相对不稳定。其原因可能是动物不同组织在不同时期，具有不同的功能和代谢特征，内参基因作为维持机体最低限度功能的基因，其表达存在差异。为了获得有意义的试验数据，研究者应根据各自特殊的组织及试验条件来选择合适的内参基因。本研究检测了新西兰白兔胚胎期、幼龄期、成年期三个阶段的肾、心、肝中6个内参基因的稳定性。结果证实，在不同的时期和器官中，最稳定的内参基因不同。理想的内参基因应该在不同组织、个体、时间和试验条件下稳定表达。但目前没有单个基因满足所有这些条件。MIQE指南推荐使用最稳定的至少三个内参基因几何平均数作为标准化RT-PCR数据更准确的方法[71,76]。因此，本研究推荐研究者根据各自试验的特点，使用上文中最稳定的至少三个基因的几何平均数作为标准化不同时期家兔肾、心、肝RT-PCR数据的指标，以确保试验组个体间的差异最小，和小变量的准确数据分析。β-actin是一种真核细胞的细胞骨架蛋白，也是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分和肌肉细丝的主要成分[85-88]。在细胞分泌、迁移及细胞质的流动和分离过程中起着重要作用，且在不同的物种间高度保守。Nygard等[89]证明β-actin在猪的不同组织表达水平的稳定性。JurszaE等[90-92]从猫科动物子宫内膜的7个内参基因中发现最稳定的是β-actin。但β-actin作为理想内参基因的稳定性也一直被质疑。NajafpanahMJ51 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱等[93]在筛选山羊不同组织中稳定表达的内参基因时发现β-actin的表达变异最大。SolomonMamo等[94]研究6个不同发育阶段的单独胚胎中12个常用的内参基因，发现不同的阶段和培养条件Ppia、H2afz和Hprt1基因是最稳定的，而经典的内参基因β-actin，显示最低的稳定性。β-actin的表达稳定性存在较大差异，可能原因是研究所用的样本及样本间的处理不同，所选择的共同研究的内参基因种类不同，物种间的差异。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是糖酵解、糖异生及光合作用过程中的关键酶，在生物进化的早期就已经出现，是最为常用的内参基因之一。WalidNachar等[95]报道家兔左心室舒张功能紊乱模型中10个内参基因中Gapdh和Hprt1基因有高度的稳定性。在最近的研究中，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（Hprt1）的稳定性得到更多的认可，常被选作内参基因[94,95]。X.Feng等[96]在研究不同日龄梅山猪和约克夏猪骨骼肌11个内参基因的表达稳定性时发现，HPRTl稳定性较好。5小结5.1MIQE指南的应用为RT-PCR分析提供一个标准，提高定量转录数据的再现性和精密分析，具有重要意义。5.2本研究检测了新西兰白兔胚胎期、幼龄期、成年期和心、肝、肾中6个内参基因（GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha、β-actin）的稳定性结果证实，在不同的时期和器官中，最稳定的内参基因不同。本研究推荐研究者根据各自试验的特点，使用上文中最稳定的至少三个基因的几何平均数作为标准化不同时期家兔肾、心、肝RT-PCR数据的指标，以确保试验组个体间的差异最小，和小变量的准确数据分析。52 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第五章Prrx1、Prrx2和Prrx3的表达图谱本节中我们选用GAPDH作为内参基因，对于家兔Prrx1、Prrx2、Prrx3在胚胎中期（E20.5d）、胚胎后期（E28.5d）、幼龄期（出生后10d）、成年期(A)各器官的表达图谱分析进行分析，以促进对这些基因在发育过程中功能和作用的理解。1材料1.1实验动物实验所有组织来自12只新西兰白兔。分为胚胎中期（E20.5d）、胚胎后期（E28.5d）、幼龄期（出生后10d）、成年期(A)4组，每组3只。采集肾、大血管、心、真皮组织、肺、大脑、肝、脾、胆囊、肌肉组织，共10种组织后置于-80℃低温冰箱保存备用。1.2实验器材CFX96(Bio-Rad，美国)，八连管(GSC，美国)，SYBGreenⅡ(TAKARA，日本)。其他实验材料见第二章1.2和1.3。2方法2.1总RNA的提取和cDNA的合成各组织取50mg剪碎后加入1mLRNAisoReagent（TaKaRa，大连，中国），进行总RNA提取。获得的RNA用50μLDEPC水稀释，-80℃保存。使用分光光度计，测定RNA的浓度和质量。并用琼脂糖凝胶电泳测定28S/18S核糖体RNA的比值对RNA完整度进行评估。所有的RNA样品的OD260/OD280比值都在1.7-2.0之间，而且RNA的完整度较高。cDNA的合成按RTReagents试剂盒（TaKaRa，日本）说明书进行。获得的cDNA10倍稀释，置于-80℃保存。2.2目的基因引物的特异性鉴定及阳性标准品的制备引物（Table5-1）由生工生物工程合成（上海，中国）。使用cDNA作为模板进行PCR，扩增6个基因的目的片段，反应条件为95℃，5min，变性95℃，40S，退火60℃，40S，延伸72℃，30S，72℃总延伸10min，16℃结束反应。循环数为30个。总PCR反应体系为25μL：Mix（TaKaRa，大连，中国）12.5μL，上53 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱下游引物各1μL（10μmol/mL），cDNA2μL，ddH2O8.5μL。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳使用100V，80mA，30min。使用DNA胶回收试剂盒（Axygen，美国）回收目的片段，溶于20μLddH2O。与pMD19-TVector质粒载体（TAKARA，日本）连接。连接体系为SolutionⅠ5μL，DNA4μL，PMD19-TVector1μL，时间为1h。转化大肠杆菌DH5α（TAKARA，大连，中国）。提取质粒（Axygen，美国），送生工生物工程进行测序验证（上海，中国）。质粒浓度测定基于全质粒，用分光光度计测量浓度（BioSpec-nano，日本），作为阳性标准品。10倍梯度稀释阳性质粒，采用10-3至10-86个浓度梯度构建标准曲线。表5-1Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的Rt-PCR引物Table5-1PrimersofPrrx1,Prrx1a,Prrx1b,Prrx2,Prrx3andGAPDHforRT-PCR基因引物序列产物长度登录号质粒浓度检测下限AmplificationPlasmidLowerlimitAccessiongenesPrimersequences(5'-3')lengthconcentrationoftestnumber(bp)（ng/μl）(copies)F4:AGAAGAGAAAGCAGCGGAGGAACXM_002715470.2Prrx110545.7814.93R4:CTCGCACAAAAGCATCAGGGTAGXM_008264097.1F5:TTCAGAACCGCCGTGCCAAGTPrrx2161XM_008251719.137.3111.93R5:GGATGAGGCCGTCCAGGAGAGATF6:ATCCTCGTCCCTCCCAAGPrrx1b69XM_008264097.158.8619.44R6:TTTTCAGTGTCTTCCGTTAGF7:AAGTCTAACAACCACCAATCTGPrrx1a169XM_002715470.259.6919.03R7:TAGTGAAGCAAGTAATGCGAGTF8:TGGTGAAGGTCGGAGTGAACGAPDH121NM_00108225340.1313.00R8:ATGTAGTGGAGGTCAATGAATGGF9:CAGAGGCGAAGTCGGACCAATPrrx394XM_008266391.138.9612.27R9:CCCGCATGAAGGCGTCCG2.3目的基因RT-PCR的扩增使用CFX96（BioRad，美国）荧光定理PCR仪进行两步法扩增。每个阶段的家兔组织都有3个生物学重复，每个样品中各内参基因都进行3次PT-qPCR扩增，分别得出各样本的各内参基因Ct值。qPCR前先使用梯度PCR确定最佳退火温度。10倍梯度稀释阳性标准品，确定各基因的扩增率和最低检测下限。PT-qPCR反应使用20μL反应体系，SYBRGreenⅡ（TAKARA，日本）10μL，上下游引物0.4μL，ddH2O7.2μL，cDNA2μL。qPCR反应条件为95℃，3min，95℃，15s，60℃，54 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱30s，循环数为40个。溶解曲线为55℃到95℃，每15S增加0.5℃，用以确定扩增特异性。2.4数据处理通过CFXManager软件获得各样本的原始数据，输入Excel进行进一步分析。3结果3.1Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因引物的特异性Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的PCR扩增产物进行2%的琼脂糖电泳，如图5-1。6对引物特异性较好，均无引物二聚体，胶回收产物及克隆测序结果均与目的基因序列完全一致，能够满足试验需要。图5-1目的片段的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.5-1AgarosegelelectrophoresisoftargetproductsNote:GAPDH,2Prrx2,3Prrx1,4Prrx1a,5Prrx1b,6Prrx33.2Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的扩增曲线和溶解曲线使用CFX96（BioRad，美国）荧光定理PCR仪对Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因进行两步法RT-PCR的扩增。获得各基因的扩增曲线及溶解曲线。如图5-2所示，RT-PCR产物只有一个特异峰，无非特异性扩增峰和无引物二聚体。Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的溶解温度分别为（84.5±0.5）、（77.75±0.25）、78.00、（89.75±0.25）、（82.25±0.25）、（84.75±0.25）。55 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱aGAPDH的扩增曲线和溶解曲线aAmplificationandmeltpeakofGAPDHbPrrx1的扩增曲线和溶解曲线bAmplificationandmeltpeakofPrrx1cPrrx1a的扩增曲线和溶解曲线cAmplificationandmeltpeakofPrrx1adPrrx1b的扩增曲线和溶解曲线dAmplificationandmeltpeakofPrrx1b56 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱ePrrx2的扩增曲线和溶解曲线eAmplificationandmeltpeakofPrrx2fPrrx3的扩增曲线和溶解曲线fAmplificationandmeltpeakofPrrx3图5-2Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的扩增曲线和溶解曲线Fig.5-2AmplificationandmeltpeakofPrrx1,Prrx1a,Prrx1b,Prrx2,Prrx3andGAPDH3.3Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因阳性标准品的制备和标准曲线的制作采用分光光度计测定PMD19-Prrx1/Prrxa/Prrxb/Prrx2/Prrx3/GAPDH基因质粒OD260/OD280，计算质粒浓度和检测下限（结果如表5-1）。将10倍梯度稀释的标准品作为模板，进行RT-PCR扩增。以获得的Ct值为纵坐标，拷贝数对数值LogCO为纵坐标做线性回归曲线。由图5-3可知，Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因在系列稀释梯度内有良好的线性关系。57 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱线性(Prrx1b)线性(Prrx1a)线性(GAPDH)线性(Prrx1)线性(Prrx2)线性(Prrx3)图5-3Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3和GAPDH基因的标准曲线Fig.5-3StandardcurveofPrrx1，Prrx1a，Prrx1b，Prrx2，Prrx3andGAPDH3.4Prrx1、Prrx1a和Prrx1b基因的表达图谱家兔Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3的表达图谱分析促进了对这些基因在发育过程中功能和作用的理解。特征性表达分析证明对于其他实验动物（特别是鼠）这些基因的理解和其在发育过程中的作用也可以同样应用于家兔的发育。本文选用GAPDH作为内参，以GAPDH的表达量为1。使用ΔCt法比较各时期Prrx1、Prrx1a、Prrx1b、Prrx2和Prrx3基因与GAPDH相比的表达量变化。由图5-4可知，在胚胎的中期（E20.5），Prrx1在各个器官组织中的表达量较高，在胚胎后期（E28.5）降低，出生后10d在肾、血管、心、真皮、大脑、肝、脾的Prrx1的表达量都达到最低，证明Prrx1基因的表达量与胚胎发育的程度有密切联系。在肺和胆囊中[30]，Prrx1的表达量有增加的趋势，可能与出生后的功能形成有关。在肾、血管、心、真皮、大脑、肝、脾、胆囊的成年阶段，Prrx1的表达量有增加的趋势。结合我们在胚胎阶段克隆得到Prrx1b，在成年阶段克隆得到的Prrx1a的事实推断，这种情况可能的原因是Prrx1的两种变异剪切体，在不同的阶段执行不同的功能，有不同的表达量变化。肌肉组织中，胚胎的中期（E20.5）Prrx1的表达量较高，胚胎后期（E28.5）、出生后10d和成年期表达量较低。58 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图5-4Prrx1基因在各时期各器官中的表达图谱Fig.5-4ExpressionpatternofPrrx1geneindifferenttimingandtissues由图5-5和5-6可知，在肾、心、肌肉组织中，在E20.5、E28.5胚胎阶段表达量较高，在10d至成年个阶段，Prrx1a的表达量较低。在脾中、E20.5、E28.5和成年阶段表达量较高，在10d表达量较低。在肾、脾和心中，Prrx1b在各阶段表达量总体表现由低到高的趋势。而在肌肉组织中，只有在E20.5时Prrx1b的表达量才较高，在E28.5，10d，成年阶段表达量都很低。Prrx1a和Prrx1b的表达量的差距可能与Prrx1基因在不同阶段和器官的功能选择有关。图5-5Prrx1a基因在各时期各器官中的表达图谱Fig.5-5ExpressionpatternofPrrx1ageneindifferenttimingandtissues59 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱图5-6Prrx1b基因在各时期各器官中的表达图谱Fig.5-6ExpressionpatternofPrrx1bgeneindifferenttimingandtissues3.5Prrx2基因的表达图谱由图5-7可知，Prrx2基因在分化自中胚层的很多器官都有表达。在家兔E20.5胚胎的心、肝、脾的表达量高。肾、真皮、肌肉，肺中的表达量较高，在血管、脑组织、脾和胆囊中的表达量较低。在家兔E28.5胚胎的肝和脾中表量有升高趋势。在家兔E28.5胚胎真皮组织中，Prrx2基因表达量较高。但在肾、血管、心、肺、胆囊、肌肉中表达量较低。E28.5胚胎脑组织中未检测到Prrx2基因表达。在E20.5胚胎表达量最高的心组织中，Prrx2基因的表达量极剧降低，出生后到成年又有升高。在出生后10d，Prrx2基因肾、心、真皮、胆囊的表达量较高。在肌肉、脾、脑组织、肺、血管的表达量较低。在成年动物脾，Prrx2基因表达量高，肾、血管、真皮中较高，其他组织中表达量较低。图5-7Prrx2基因在各时期各器官中的表达图谱Fig.5-7ExpressionpatternofPrrx2geneindifferenttimingandtissues60 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱3.6Prrx3基因的表达图谱由图5-8可知，Prrx3基因主要在中胚层和外胚层的发育成的很多器官都有表达。在E20.5的家兔胚胎组织中，Prrx3基因在肾、肌肉和胆囊的表达量高。在血管、心、真皮、肺、肝、脾的表达量较高。在脑组织表达量较低。在E20.5的家兔胚胎组织中，脾有最高的表达量，在肾、血管、心的表达量较高，在真皮、脑组织、肝、胆囊的表达量较低。在肺、肌肉组织中未检测到Prrx3基因表达。在出生后10d的家兔组织中，Prrx3基因在真皮组织有最高的表达量。在肾、血管、心、肺、肝、脾、胆囊表达量较低。在脑组织和肌肉组织中未检测到Prrx3基因的表达。在成年动物，真皮组织中Prrx3基因有最高的表达量，其他组织中均较低。图5-8Prrx3基因在各时期各器官中的表达图谱Fig.5-8ExpressionpatternofPrrx3geneindifferenttimingandtissues4讨论Prrx1基因的表达量变化，可能是由于两种变异剪切体的功能和主要表达时期不同引起的。Prrx1有两种变异剪切体Prrx1a和Prrx1b，他们对靶基因和肢体发育有不同的作用[97-99]。Prrx1a在四肢组织培养中过表达导致前软骨形成的浓缩和软骨瘤的增多，但Prrx1b的过分表达却导致它们减少。Prrx1a可以增加具有增殖活性的细胞的百分比，减少细胞调亡，但是Prrx1b促进细胞的调亡[98,100,101]。在软骨形成早期阶段，间充质细胞浓集过程中只有Prrx1a表达。高水平的Prrx1b在软骨膜形成时才表达。有研究表明，产生这两种亚型的机制和Prrx1a与Prrx1b表达量的比值，在软骨形成中起关键作用。人胚胎的心、肾、肺、骨骼肌组织中Prrx2表达量都很高[15]。其他胚胎组织，如脾和胸腺，Prrx2表达的表达量中等。然而在大脑和肝表达量最低。所有这些组织中61 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱心、肺、胎盘和胰腺，在成人组织表达水平较高。相对中等的表达在肾和骨骼肌中检测到。成人肾和骨骼肌中Prrx2的表达与胚胎中表达相比分别下降了两到三倍。不是全部组织都下降，因为Prrx2标准化后的表达在成人心组织比胚胎组织增加了近两倍。Prrx2在人肾和肺中被检测到，但小鼠和家禽的这些组织没有表达Prrx2的报道[15]。SYBRGreen法是RT-PCR的常用方法[102,103]。在RT-PCR反应体系中，SYBRGreen和DNA双链的小沟结合，发射荧光信号。具有使用方便、价格低廉，适用于各种模板的优点，现已成为了分子生物学研究中的重要工具，但是SYBRGreen法也有许多缺陷。由于SYBRGreen还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、与非特异性扩增产物结合，从而造成结果不准确。因此采用该方法对于引物的特异性要求较高。目前，PCR技术日新月异，数字PCR(digitalPCR，dPCR)和微滴数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）已经开始应用于生命科学的各个领域[103-105]。相信在不久的将来，会成为检测核酸分子普及的应用方法。5小结5.1构建pET32a(+)-Prrx1/Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3/GAPDH阳性标准品，建立合格的检测方法。5.2分析了Prrx1，Prrx2和Prrx3基因的表达图谱。确定了它们在各组织器官中的表达量。并比较的Prrx1的两种变异剪切体Prrx1a和Prrx1b的表达表达差异，为Prrx1，Prrx2和Prrx3基因的进一步研究提供参考。62 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱第六章Prrx家族蛋白的免疫组化分析免疫组织化学简称免疫组化，是免疫学与细胞化学相结合的分支学科，是应用免疫学、组织化学的原理,对组织切片中抗原进行原位的定位、定性、定量分析的一种技术。免疫组化是实验室和临床上诊断和检测的重要方法。本研究使用免疫组化的方法对Prrx蛋白进行分析，确定Prrx蛋白在家兔各时期，各器官中的表达。1材料1.1实验仪器高倍显微镜（Olympus，日本），1512切片机（Leitz，德国）1.2主要试剂鼠抗人Prrx2(Abnova，台湾)；HRP标记的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥，中国），4%多聚甲醛(安雅，中国)，中性树胶、石蜡、苏木精、无水乙醇、氧化汞、冰醋酸、钾明矶、伊红。DAB显色液。1.3溶液配制Harris苏木精的配制(Harris1900)：苏木精，2.5g；无水乙醇，25m1；钾明矶(硫酸铝钾)，50g；去离子水，500ml；氧化汞，1.25g；冰醋酸，20m1。1%伊红酒精的配制：伊红(水溶)5g；75%酒精500ml。（用少许蒸馏水将伊红调成浆糊状，加入75%酒精，边加边搅拌，直至完全溶解。加入少许冰醋酸，溶液即可变为鲜红色。）胚胎中期（E20.5）、胚胎后期（E28.5）、幼龄期（10d）、成年期（A）的新西兰白兔各一只。其他实验材料见第二章1.2和1.3。2方法2.1标本的取材及处理各阶段的动物处死后采集心、脾、肝、肺、肾和脑器官的部分组织，用4℃生理盐水漂洗两次，洗净创面组织淤血，以4%多聚甲醛固定，置于4℃保存，24h更换一次固定液，制作组织石蜡切片。63 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱2.2石蜡切片的制作1）组织固定：4%多聚甲醛48h。2）逐级乙醇脱水：50%乙醇1h；75%乙醇12h；85%乙醇12h；95%乙醇12h；无水乙醇2h；无水乙醇2h；无水乙醇2h。3）透明：乙醇、二甲苯等量混合液1h；二甲苯2h；二甲苯2h。4）浸蜡：二甲苯、石蜡等量混合液2h；石蜡60℃lh；石蜡(软)60℃lh。5）包埋：溶解蜡，冷却硬化后修切蜡块。注意组织块排列整齐、迅速，以免石蜡块凝固。6）切片、展片和裱片：切片厚度为6μm。小镊子轻轻将切开的石蜡带放在乙醇溶液表面，使其充分展开。放于载玻片中央，60℃烘烤lh至石蜡融化。2.3HE染色1）脱蜡(二甲苯5min；二甲苯5min)。2）逐级乙醇水化：无水乙醇1min；无水乙醇1min；95%乙醇1min；90%乙醇lmin；80%乙醇1min；70%酒精lmin。3）苏木素染色5min；1%盐酸酒精分化30s；自来水浸泡l5min。4）1%伊红染色2min。5）逐级乙醇脱水：70%乙醇lmin；80%乙醇lmin；90%乙醇lmin；95%乙醇lmin；无水乙醇lmin；无水乙醇lmin。6）二甲苯透明：石炭酸二甲苯（1：3）lmin；二甲苯lmin；二甲苯lmin。7）中性树胶封片。2.4免疫组织化学检测1）烤片：石蜡切片置于60℃烘箱内烘烤1h。2）脱蜡及水化：二甲苯10min；二甲苯10min。无水乙醇5min；无水乙醇5min；95%乙醇5min；85%乙醇5min；75%乙醇5min；60%乙醇5min；40%乙醇5min；20%乙醇5min；自来水1min；双氧水1min。3）抗原修复：10mMPH6.0的柠檬酸盐缓冲液中微波抗原修复10min，自然冷却。4）3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。室温孵育l0min。5）PBS（pH7.4）洗涤3次，每次5min。64 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱6）滴加鼠抗人Prrx2IgG（浓度1：1000），37℃孵育2h。7）PBS（PH7.4）洗涤3次，每次3min。8）滴加HRP标记的羊抗鼠IgG（浓度1：500），37℃孵育30min。9）pH7.4的PBS洗涤三次，每次2min。10）DAB显色5min。11）苏木精复染2min，脱水、透明，中性树胶封片。2.5结果观察使用Olympus高倍显微镜观察并记录实验结果。3结果HE染色结果显示，各组织均为正常组织，未发现组织异常变化。3.1新西兰白兔肝组织中Prrxs的表达由图6-1至图6-4可知，Prrx家族在肝中有表达，表达区域比较分散。×40×10图6-1E20.5家兔肝中Prrxs蛋白的表达Fig.6-1PrrxsproteinexpressionofE10.5Oryctolaguscuniculusliver65 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-2E28.5家兔肝中Prrxs蛋白的表达Fig.6-2PrrxsproteinexpressionofE28.5Oryctolaguscuniculusliver×40×10图6-310d家兔肝中Prrxs蛋白的表达Fig.6-3Prrxsproteinexpressionof10dOryctolaguscuniculusliver66 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-4成年家兔肝中Prrxs蛋白的表达Fig.6-4PrrxsproteinexpressionofAdultOryctolaguscuniculusliver3.2新西兰白兔肾组织中Prrxs的表达由图6-5至图6-7可知，Prrx家族在肾中的表达量较高，主要集中在肾小管及周边区域。×40×10图6-5E28.5家兔肾中Prrxs蛋白的表达Fig.6-5PrrxsproteinexpressionofE28.5Oryctolaguscuniculuskidney67 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-6出生后10d家兔肾中Prrxs蛋白的表达Fig.6-6Prrxsproteinexpressionof10dOryctolaguscuniculuskidney×40×10图6-7成年家兔肾中Prrxs蛋白的表达Fig.6-7PrrxsproteinexpressionofAdultOryctolaguscuniculuskidney3.3新西兰白兔心组织中Prrxs的表达由图6-8至6-10可知，Prrx家族在新西兰白兔心组织中有表达，而且表达量较高。68 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-8E28.5家兔心中Prrxs蛋白的表达Fig.6-8PrrxsproteinexpressionofE28.5Oryctolaguscuniculusheart×40×10图6-9出生后10d家兔心中Prrxs蛋白的表达Fig.6-9Prrxsproteinexpressionof10dOryctolaguscuniculusheart69 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-10成年家兔心中Prrxs蛋白的表达Fig.6-9PrrxsproteinexpressionofAdultOryctolaguscuniculusheart3.4新西兰白兔肺组织中Prrxs的表达由图6-11至6-12可知，Prrx家族在新西兰白兔肺泡壁中有表达。在胚胎阶段，肺泡未充盈。×40×10图6-10E20.5家兔肺中Prrxs蛋白的表达Fig.6-10PrrxsproteinexpressionofE20.5Oryctolaguscuniculuslung70 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-1110d家兔肺中Prrxs蛋白的表达Fig.6-11Prrxsproteinexpressionof10dOryctolaguscuniculuslung3.5新西兰白兔脑组织中Prrxs的表达由图6-12至6-13可知，Prrx家族在新西兰白兔脑组织中有表达。×40×10图6-12E20.5家兔脑中Prrxs蛋白的表达Fig.6-12PrrxsproteinexpressionofE20.5Oryctolaguscuniculusbrain71 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-13E28.5家兔脑中Prrxs蛋白的表达Fig.6-13PrrxsproteinexpressionofE28.5Oryctolaguscuniculusbrain3.6新西兰白兔脾组织中Prrxs的表达由图6-14至6-15可知，Prrx家族在新西兰白兔脾组织中有表达，表达量高。×40×10图6-1410d家兔脾中Prrxs蛋白的表达Fig.6-14Prrxsproteinexpressionof10dOryctolaguscuniculusspleen72 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱×40×10图6-15成年家兔脾中Prrxs蛋白的表达Fig.6-15PrrxsproteinexpressionofAdultOryctolaguscuniculusspleen4讨论在人胚胎和成人的肝中，Prrx2的表达量都较低[15]。但鼠和鸡肝和肺这两个组织中都没有检测到Prrx2表达[10]。在纤维化的的肝中[106]，Prrx2和Prrx1表达量都急剧上调。在肝星状细胞和肝脏纤维化中[32]，RBMS3通过序列特异绑定Prrx1mRNA，控制PRX1表达量和间接胶原合成，有助于肝脏纤维化。人肾中Prrx2的表达量较高，是低表达的组织（大脑和肝）的十倍左右[15]。小鼠心脏的表达图谱显示[10,14,15]，至少从E8.5，Prrx1表达可以从心检测到，最初在心内膜，然后在半月瓣和房室瓣发展。Prrx2发展早期心肌表达分散，然后在血管心室隔膜和部分动脉管表达量高。而Prrx3则在心脏发育的早期阶段发挥作用，与心律快慢有关[44,55,60,107]。心脏发育过程中，Prrx3特异性的在静脉窦区域表达[108]。它可以通过Bmp4基因对窦房结开关和起搏器系统的发育起到重要作用。Prrx1基因在成人的心，肺和骨骼肌与胚胎相比都有2至4倍的增加，唯一降低的组织是肾[10,11,15]。妊娠第17.5d鼠心组织中Prrx2的Northern分析检测到表达量显著降低。这时，在总RNA样品中它还可以很容易被检测到，但出生后几天内到成年，它就很难在polyA(+)RNA样品中检出了[10]。与鼠心相比，人73 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱心脏中PRRX2表达在胚胎和成人中的表达水平相似。鼠在心成纤维细胞和心肌细胞中表达Prrx2。免疫组化的结果和RT-PCR的结果有些不同，可能的原因是，基因的转录后调节。例如，有学者称[30]尽管在心肌细胞中发现了mRNA的表达，没有在胚胎和成年动物的心肌发现Prrx1的蛋白的表达。为为何Prrxs基因变异小鼠为何缺乏心脏畸形提供了解释。证明Prrx1表达受到了转录调节。在Prrx1和鸡胚心脏蛋白表达之间的矛盾说明脊椎动物调节机制的保守性。在这个实验中，我们在许多器官中检测到了Prrx1、Prrx2和Prrx3蛋白的表达。Prrx基因家族在不同时期各个器官的表达量的高低和表达部位的改变，都与它们相应的功能和发育阶段有很大关系。然而由于缺乏有效的单克隆抗体，并且Prrx基因家族高度保守，目前难以区分各自的表达[31]。5小结在本试验中，第一次在家兔许多器官中检测到Prrx1、Prrx2和Prrx3蛋白的表达。然而由于缺乏有效的单克隆抗体，并且Prrx基因家族高度保守，目前难以区分不同基因各自的表达。74 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱全文结论1.克隆得到家兔Prrx1a（登录号：KP726284），开放阅读框全长738bp，编码氨基酸245个，分子量27.269KD，理论等电点为9.48。蛋白不稳定系数为55.67，该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx1a拟表达蛋白分子式为C1171H1881N363O377S6。N端为Met，C端为Asn。Prrx1a编码氨基酸序列整体表现疏水性，为非跨膜蛋白。Prrx1a氨基酸的糖基化位点有3个，磷酸化位点有19个，其中丝氨酸(Ser)有13个位点，酪氨酸(Tyr)有3个位点，苏氨酸(Thr)有3个位点。Prrx1a氨基酸序列的二级结构中，α-螺旋区域共56个氨基酸，占32.94%；无规则卷曲区域共76个氨基酸，占44.71%；延伸链38个氨基酸，占22.35%。克隆得到Prrx1b（登录号：KM222500.1），开放阅读框全长654bp，编码氨基酸217个，分子量24.369KD，理论等电点为9.17。蛋白不稳定系数为59.99，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx1b拟表达蛋白分子式为C1049H1674N328O333S5。N端为Met，C端为Phe。蛋白整体表现为疏水性。编码氨基酸序列整体表现疏水性，为非跨膜蛋白。Prrx1b氨基酸的糖基化位点有3个，磷酸化位点有17个，其中丝氨酸(Ser)有12个位点，酪氨酸(Tyr)有2个位点，苏氨酸(Thr)有3个位点。Prrx1b氨基酸序列的二级结构中，α-螺旋区域共106个氨基酸，占48.85%；无规则卷曲区域共97个氨基酸，占44.70%；延伸链14个氨基酸，占6.45%。克隆得到Prrx2部分开放阅读框471bp，编码氨基酸156个，分子量17.620KD。理论等电点为11.08。蛋白不稳定系数为65.98，提示该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx2拟表达多肽分子式为C770H1228N242O228S3。N端为Ala，C端为Asn。编码氨基酸序列整体表现疏水性，为非跨膜蛋白。Prrx2氨基酸的糖基化位点有3个，磷酸化位点有15个，其中丝氨酸(Ser)有9个位点，酪氨酸(Tyr)有3个位点，苏氨酸(Thr)有3个位点。Prrx2氨基酸序列的二级结构中，α-螺旋区域共80个氨基酸，占51.28%；无规则卷曲区域共66个氨基酸，占42.31%；延伸链10个氨基酸，占6.41%。克隆得到Prrx3（登录号：KP726285）基因，开放阅读框全长666bp，与XM_008266391.1相比第463位为T，但是不引起氨基酸序列的改变。Prrx3编码氨基酸221个，分子量24.404KD，理论等电点为9.42。该蛋白可能为不稳定蛋白。Prrx375 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱拟表达多肽链的分子式为C1068H1712N324O316S8。N端为Met，C端为Leu。编码氨基酸序列整体表现疏水性，为非跨膜蛋白。Prrx1a氨基酸的糖基化位点有3个，磷酸化位点有15个，其中丝氨酸(Ser)有10个位点，酪氨酸(Tyr)有2个位点，苏氨酸(Thr)有3个位点。Prrx3氨基酸序列的二级结构中，α-螺旋区域共137个氨基酸，占61.99%；无规则卷曲区域共74个氨基酸，占33.48%；延伸链10个氨基酸，占4.52%。2.SDS-PAGE分析结果表明，重组质粒pET32a(+)-Prrx1a的在BL21细胞中能够表达44kDa左右大小的特异蛋白条带。优化诱导表达调节结果表明，在37℃，IPTG浓度为1.0mM，诱导6h时表达量最高。Westernblot结果显示，融合蛋白pET32a(+)-Prrx1a有良好的抗原性，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。重组质粒pET32a(+)-Prrx1b的在BL21细胞中能够表达41kDa左右大小的特异蛋白条带。优化诱导表达调节结果表明，在37℃,IPTG浓度为1.0mM，诱导6h时表达量最高。Westernblot结果显示，融合蛋白pET32a(+)-Prrx1b有良好的抗原性，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。重组质粒pET32a(+)-Prrx3的在BL21细胞中能够表达41kDa左右大小的特异蛋白条带。优化诱导表达调节结果表明，在37℃,IPTG浓度为1.0mM，诱导过夜时表达量最高。Westernblot结果显示，融合蛋白pET32a(+)-Prrx3有良好的抗原性，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。重组质粒pET32a(+)-Prrx2的在BL21细胞中能够表达34kDa左右大小的特异蛋白条带。优化诱导表达调节结果表明，在37℃,IPTG浓度为1.0mM，诱导6h时表达量最高。Westernblot结果显示，融合蛋白pET32a(+)-Prrx2有良好的抗原性，能够被鼠抗人Prrx2IgG识别。3.本研究检测了新西兰白兔胚胎期、幼龄期、成年期和心、肝、肾中6个内参基因（GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha、β-actin）的稳定性结果证实，在不同的时期和器官中，最稳定的内参基因不同。本研究推荐研究者在进行新西兰白兔相关试验时，根据各自试验的特点，使用上文中最稳定的至少三个基因的几何平均数作为标准化不同时期家兔肾、心、肝RT-PCR数据的指标，以确保试验组个体间的差异最小，和小变量的准确数据分析。76 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱4.RT-PCR结果表明，在胚胎的中期（E20.5），Prrx1在各个器官组织中的表达量较高，在胚胎后期（E28.5）降低，出生后10d在肾、血管、心、真皮、大脑、肝、脾的Prrx1的表达量都达到最低，证明Prrx1基因的表达量与胚胎发育的程度有密切联系。在肺和胆囊中，Prrx1的表达量有增加的趋势，可能与出生后的功能形成有关。在肾、血管、心、真皮、大脑、肝、脾、胆囊的成年阶段，Prrx1的表达量有增加的趋势。肌肉组织中，胚胎的中期（E20.5）Prrx1的表达量较高，胚胎后期（E28.5），出生后10d和成年期表达量较低。在肾、心、肌肉组织中，在E20.5、E28.5胚胎阶段表达量较高，在10d至成年个阶段，Prrx1a的表达量较低。在脾中，E20.5、E28.5和成年阶段表达量较高，在10d表达量较低。在肾，脾和心中，Prrx1b在各阶段表达量总体表现由低到高的趋势。而在肌肉组织中，只有在E20.5时Prrx1b的表达量才较高，在E28.5、10d、成年阶段表达量都很低。Prrx1a和Prrx1b的表达量的差距可能与Prrx1基因在不同阶段和器官的功能选择有关。Prrx2基因在分化自中胚层的很多器官都有表达。在家兔E20.5胚胎的肝、脾的表达量高。肾、真皮、肌肉、肺中的表达量较高，在血管、脑组织、脾和胆囊中的表达量较低。在家兔E28.5胚胎的肝和脾中表量高有升高趋势。在家兔E28.5胚胎真皮组织中，Prrx2基因表达量较高。但在肾、血管、心、肺、胆囊、肌肉中表达量较低。E28.5胚胎脑组织中未检测到Prrx2基因表达。在E20.5胚胎表达量最高的心组织中，Prrx2基因的表达量极剧降低，出生后到成年又有升高。在出生后10d，Prrx2基因肾、心、真皮、胆囊的表达量较高。在肌肉、脾、脑组织、肺、血管的表达量较低。在成年动物脾，Prrx2基因表达量高，肾、血管、真皮中较高，其他组织中表达量较低。Prrx3基因主要在中胚层和外胚层的发育成的很多器官都有表达。在E20.5的家兔胚胎组织中，Prrx3基因在肾、肌肉和胆囊的表达量高。在血管、心、真皮、肺、肝、脾的表达量较高。在脑组织表达量较低。在E20.5的家兔胚胎组织中，脾有最高的表达量，在肾、血管、心的表达量较高，在真皮、脑组织、肝、胆囊的表达量较低。在肺、肌肉组织中未检测到Prrx3基因表达。在出生后10d的家兔组织中，Prrx3基77 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱因在真皮组织有最高的表达量。在肾、血管、心、肺、肝、脾、胆囊表达量较低。在脑组织和肌肉组织中未检测到Prrx3基因的表达。在成年动物，真皮组织中Prrx3基因有最高的表达量，其他组织中均较低。5.免疫组化结果表明，Prrx1、Prrx2、Prrx3蛋白在各时期，心、脾、肝、肺、肾和脑中都有表达。Prrx1、Prrx2、Prrx3蛋白家族在不同时期各个组织的表达量的高低和表达部位的变换，都与它们相应的功能和发育阶段有很大关系。然而由于缺乏有效的单克隆抗体,并且Prrx基因家族高度保守，目前难以区分各自的表达。78 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱全文创新点1.本论文首次克隆得到家兔Prrx1基因的两种变异剪切体Prrx1a（登录号：KP726284）和Prrx1b（登录号:KM222500.1），Prrx2基因，Prrx3（登录号:KP726285）基因，并对Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3进行了生物信息学分析。2.本论文首次构建了Pet32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合质粒。并使用BL21细胞进行融合蛋白表达，优化了诱导表达条件，纯化了融合蛋白，并对Pet32a(+)-Prrx1a/Prrx1b/Prrx2/Prrx3融合蛋白进行Westernblot分析，确定了它们的抗原性。3.对家兔不同时器官，不同时期的内参基因的稳定性进行分析，在家兔的常用的六个内参基因GAPDH、HPRT1、18SrRNA、B2M、Sdha、β-actin中，β-actin、HPRTl、GAPDH是表达比较稳定的内参。4.以GAPDH为内参基因，本论文首次对家兔在不同时期，各器官中的Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因的表达量进行RT-PCR分析。确定了Prrx1a、Prrx1b、Prrx2、Prrx3基因的表达量，并比较的Prrx1的两种变异剪切体Prrx1a和Prrx1b的表达表达差异，为Prrx1、Prrx2和Prrx3基因的进一步研究提供参考。5.本论文首次使用鼠抗人Prrx2IgG为抗体，对家兔在不同时期，心、脾、肝、肺、肾和脑中的Prrx1、Prrx2、Prrx3蛋白进行免疫组化分析。确定了Prrx1、Prrx2、Prrx3蛋白的表达。79 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱参考文献[1]GrierDG,ThompsonA,KwasniewskaA,etal.ThepathophysiologyofHOXgenesandtheirroleincancer[J].JPathol,2005,205(2):154-71.[2]KrumlaufR.Hoxgenesinvertebratedevelopment[J].Cell,1994,78(2):191-201.[3]LumsdenA,KrumlaufR.Patterningthevertebrateneuraxis[J].Science,1996,274(5290):1109-15.[4]TanabeY,JessellTM.Diversityandpatterninthedevelopingspinalcord[J].Science,1996,274(5290):1115-23.[5]Alvarez-BoladoG,RosenfeldMG,SwansonLW.ModelofforebrainregionalizationbasedonspatiotemporalpatternsofPOU-IIIhomeoboxgeneexpression,birthdates,andmorphologicalfeatures[J].JCompNeurol,1995,355(2):237-95.[6]RosenfeldMG,BachI,ErkmanL,etal.Transcriptionalcontrolofcellphenotypesintheneuroendocrinesystem[J].RecentProgHormRes,1996,51:217-38.[7]LamonerieT,TremblayJJ,LanctôtC,etal.Ptx1,abicoid-relatedhomeoboxtranscriptionfactorinvolvedintranscriptionofthepro-opiomelanocortingene[J].GenesDev,1996,10(10):1284-95.[8]ThorS,EricsonJ,BrännströmT,etal.ThehomeodomainLIMproteinIsl-1isexpressedinsubsetsofneuronsandendocrinecellsintheadultrat[J].Neuron,1991,7(6):881-9.[9]KrumlaufR,HollandPW,McVeyJH,etal.Developmentalandspatialpatternsofexpressionofthemousehomeoboxgene,Hox2.1[J].Development,1987,99(4):603-17.[10]LeussinkB,BrouwerA,elKhattabiM,etal.Expressionpatternsofthepaired-relatedhomeoboxgenesMHox/Prrx1andS8/Prx2suggestrolesindevelopmentoftheheartandtheforebrain[J].MechDev,1995,52(1):51-64.[11]CserjesiP,LillyB,BrysonL,etal.MHox:amesodermallyrestrictedhomeodomainproteinthatbindsanessentialsiteinthemusclecreatinekinaseenhancer[J].Development,1992,115(4):1087-101.[12]KernMJ,ArgaoEA,BirkenmeierEH,etal.GenomicorganizationandchromosomelocalizationofthemurinehomeoboxgenePmx[J].Genomics,1994,19(2):334-40.[13]KernMJ,WitteDP,ValeriusMT,etal.AnovelmurinehomeoboxgeneisolatedbyatissuespecificPCRcloningstrategy[J].NucleicAcidsRes,1992,20(19):5189-95.[14]OpsteltenDJ，VogelsR，RobertB，etal.Themousehomeoboxgene，S8，isexpressedduringembryogenesispredominantlyinmesenchyme[J].MechDev,1991,34(1):29-41.[15]NorrisRA,ScottKK,MooreCS,etal.HumanPRRX1andPRRX2genes:cloning,expression,genomiclocalization,andexclusionasdiseasegenesforNagersyndrome[J].MammGenome,2000,11(11):1000-5.[16]KongsuwanK,WebbE,HousiauxP,etal.Expressionofmultiplehomeoboxgeneswithindiversemammalianhaemopoieticlineages[J].EMBOJ,1988,7(7):2131-8.[17]vanSchaickHS,SmidtMP,RovescalliAC,etal.HomeoboxgenePrx3expressioninrodentbrainandextraneuraltissues[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(24):12993-8.[18]张玉娟,催巍.人SHOX2基因的生物学作用及与疾病关系的研究[J].中国卫生检验杂志,2013,23（9）:2112-4.80 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家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱致谢三年的时间匆匆而逝，暮然回首，往事如历。随着无法改变的失去，换来的是成长、是历练、是坚持、是失去、也是坦然。在三年的研究生生涯里，首先感谢我的导师杨晓农教授的悉心教导。杨晓农导师渊博的学识、严谨的科学态度和高尚的品质使我收获颇丰。衷心感谢杨老师三年来对我的谆谆教诲。杨老师的训诫我将铭记在心。感谢李键教授、汤承教授、刘群教授、刘亚刚教授、岳华教授、张焕容教授、罗薇教授、杨发龙教授、兰道亮副教授、张斌副教授等西南民族大学临床兽医教研室全体老师对我的指导和教诲。感谢吴玉疆、刘倩、常向彩等师兄师姐对我的无私指导与帮助。感谢文娟、曾婉秋、荣茂伶、翟禹涵、王栋、邓伯雄、李春阳等同学在实验过程中对我的热情帮助。感谢我的父母，弟弟我的支持，他们的鼓励使我不断进步，顺利完成学业。陈瑞2015年4月88 家兔Prrx基因家族：克隆分析、原核表达和表达图谱作者声明本人声明:本学位论文成果是本人在西南民族大学读书期间在导师指导下取得的,论文成果归西南民族大学所有。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得西南民族大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本人同意学校根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等有关规定保留本人学位论文并向国家有关部门或资料库送交论文纸件或电子版本，允许论文被查阅和借阅；本人同意西南民族大学可以将论文的全部或者部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其它复制手段和汇编学位论文，同时授权中国学术期刊电子杂志社等单位将本论文收录到《中国优秀硕士学位论文全文数据库》、《中国博士学位论文全文数据库》等数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：日期：年月日89
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