家蚕尿酸氧化酶基因的克隆及其原核表达研究

《家蚕尿酸氧化酶基因的克隆及其原核表达研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要屎酸氧化酶(UrgeOxidase，UO，EC1．7．3，3)是生物体内嘌呤代谢的一个关键酶，可催化尿酸形成尿囊酸。大多数的原核和真核生物都有完整的尿酸氧化酶基因，产生具生物活性的尿酸氧化酶，以尿囊酸作为代谢最终产物。在人类和一‘些灵长类动物的尿酸氧化酶基因中存在无义突变，尿酸氧化酶不具活性。它们在嘌呤降解途径中排泄尿酸作为最终产物。重组尿隘氧化酶可作为l

2、i{i废治疗高屎酸症和预防肿瘤溶解症候群的有效药物。利用基因工程方法构建高效表达载体，在适当表达系统中表达尿酸氧化酶基因，是提高尿酸氧化酶产量的首选方法。在国外已有若干种碌酸氧化酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达出有生物活性的蛋

3、白质。但在国内还未见此方面的研究。本文在家蚕尿酸氧化酶基因的克隆和高教表达方面进行了研究。利用DNA同源序列，PCR方法扩增得到尿酸氧化酶基因，在原核表达系统pET28一a／E．coliBL21(DE3)中进行了表达。主要包括以下内容：1．尿酸氧化酶基因预测：研究用生物信息学方法．利用果蝇的尿酸氧化酶同源序列在家蚕基因组数据库中进行同源性检索，检索到的家蚕尿酸氧化酶序列。2．家蚕尿酸氧化酶基因的克隆及原核表达：根据预测序列设计引物，用RT-PCR检测和克隆测序验证，成功地克隆到家蚕尿酸氧化酶基因的完整开放阅读框，并克隆到pET28．a载体上，重组质粒转化表达宿主菌Escherichia

4、coliBL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白，经SDS．PAGE分析发现目的蛋白表达，但是通过活性测定，在粗酶液中并没有检测到有活性的尿酸氧化酶，这可能是因大肠杆菌里表达真核生物的蛋白质，在原核系统里，该蛋白质得不到正确的翻译后修饰，使得该蛋白质失去了本有的功能。3家蚕尿酸氧化酶基因的序列分析：克隆的eDNA长为1088bp，ORF长1014bp，编码337个氨基酸残基，预测分子量为38．18kD，等电点为690，基因名暂定为Bmuo。家蚕尿酸氧化酶在氨基酸水平上与果蝇和按蚊的尿酸氧化酶的相似性分别为45．6％和51％．在第91个氨基酸残基处具有Asn．Set—

5、X．Valflle-Val／Ile-Ala／Pro—Thr-Asp-Ser／Thr．x．Lys．Asn的高度保守序列，这一序列在真核生物和原核生物中均广泛存在，可能与尿酸氧化酶的酶活性有关。与其他物种尿酸氧化酶的聚类分析中，家蚕与果蝇、按蚊聚为一类，说明昆虫问结构较保守。关键词：家蚕；尿酸氧化酶；原核表达；序列分析AbstractUrateoxidase(uo)，anenzymethatcatalyzestheoxidationofuricacidtoallantoin，playsanimportantroleintilemetabolismofpurines．Mostprokm3'o

6、teandeukaryotehaveintacturateoxidasegene(ZtO)thatproducesurateoxidaseactivityandexcretesallantoinastheendproductofpminemetabolismBecauseofasinglenonsensemutation，humanandcertainnon—humanprimateslackurateoxidaseandexcreteuricacidastheendproductUtilizinggeneengineeringmethodstoconstructepressionve

7、ctorofhighefficiency，andexpressionofuricacidinproperexpressionsystemwhichcanelevateyieldofuricase，ThereareseveraIuricasesbeenclonedandexpressionofbiologyactivityproteinintheEcoiloverseas．Butthereisnoresearchinteriorly．Inthispaperwestudiedontheuricaseofsilkworm，whichutilizedhomologDNAsequenceofDr

8、osophilamelanogasterandPCRtogetDNAsequenceofuricaseinsilkworm，andthenexpressionintheProkaryoticExpressionSystem．CloningandidentificationoftheuricasegeneinBmort，hereinWCpresentamolecularcharacterizationofBmoriwhichincludes：lI