赖氨酰氧化酶基因原核表达克隆的构建

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1、赖氨酰氧化酶基因原核表达克隆的构建作者：摆茹，杨伟，赵建宁，韩梅【摘要】目的克隆编码人赖氨酰氧化酶(hLOX)的基因片段，并构建含有该基因的重组原核表达质粒，为制备基因工程化的重组hLOX奠定基础。方法从人皮肤成纤维细胞中抽提RNA，通过RT-PCR扩增LOX编码序列(750bp)，所得目的基因插入原核表达载体质粒pET28a，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒pET28a-hLOX经双酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果载体质粒pET28a中插入的基因片段与hLOX基因序列完全相同。结论成功构建含有人LOX基因的重组表达质粒。【关键词】

2、赖氨酰氧化酶;RT-PCR;重组质粒赖氨酰氧化酶(Lysyloxidase，LOX)是一种细胞外依赖铜的胺氧化酶，参与细胞外基质中胶原和弹性蛋白赖氨酸残基交联，在胶原和弹性蛋白由可溶性单体转变为不溶性纤维过程的初始阶段发挥重要作用，对建立细胞外基质和维持基质结构和功能正常，以及组织器官发育、创伤修复、细胞运动等都具有重要意义[1-2]。本研究选取32KD的赖氨酰氧化酶基因为研究对象，拟从人皮肤成纤维细胞中克隆出目的基因，构建重组表达质粒，为今后表达重组hLOX、深入研究该蛋白的结构和功能打下基础。7　　1材料与方法　　1.1细胞

3、与试剂人皮肤成纤维细胞、原核表达质粒pET-28a，E.coilDH5ɑ，均由军事医学科学院微生物与流行病研究所一室提供。DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料所，胰蛋白酶购自Difco公司。TRIZOL试剂购自Gibco公司，TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)、EcoRI、HindIII内切酶、切胶回收试剂盒、小量质粒提取、DNAmarker均购自TaKaRa公司。　　1.2细胞培养细胞培养于含10%胎牛血清/青霉素(100U/mL)/庆大霉素(100U/mL)的DMEM培养液

4、中，置于饱和湿度，37℃、5%CO2的孵箱中生长。待细胞生长至对数期，进行总RNA的提取。　　1.3总RNA的提取和cDNA的合成按说明书步骤用Trizol抽提细胞总RNA。测定RNA样品在λ=260nm和λ=280nm的光密度值确定RNA的纯度，按1OD260=40μgRNA计算RNA的浓度。按照cDNA第一链合成试剂盒说明合成cDNA第一链。　　1.4PCR扩增目的基因hLOX根据GeneBank公布的hLOX序列(GeneBankNM_002317)和载体质粒pET28a的多克隆位点和阅读框图谱设计引物，选择EcoRⅠ和H

5、indⅢ作为将hLOX基因插入载体的内切酶。引物序列为：上游：5'-CGGAATTCATGGACGACCCTTACAACCCCT-3'7含起始密码和EcoRI酶切位点;下游：5'-GCGCAAGCTTCTAATACGGTGAAATTGTGC-3'含终止密码和HindIII酶切位点。以1ststrandcDNA为模板扩增带有酶切位点的目的基因，目的片段约750bp。同时用管家基因(GAPDH)作为对照检测总RNA的完整性和逆转录的效率。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯下迅速切割含750bp条带的凝胶条块，用小量胶回收试剂盒提

6、取纯化PCR产物。　　1.5重组表达质粒的构建及核苷酸序列分析回收产物hLOX与质粒pET28a分别用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切4h，酶切产物分别割胶回收。将目的片段与载体质粒用T4DNAligase连接过夜后转化E.coilDH5α感受态细菌。挑克隆经菌落PCR，双酶切鉴定为阳性克隆，保种待用。经筛选的重组质粒作核苷酸序列分析。并用DNAstar软件将测序结果与GeneBank公布的hLOX序列(GeneBankNM_002317)对比，同时鉴定插入片段两侧的酶切位点、起始及终止密码。测序正确的质粒命名为pET28a-h

7、LOX。　　2结果　　2.1目的基因hLOX的RT-PCR电泳　　RT-PCR扩增后样品组特异性扩增产物大小750bp，管家基因对照组约500bp，见图1。　　2.2重组原核表达质粒双酶切鉴定7　　重组表达载体pET28a/hLOX经内切酶EcoRⅠ、HindIII酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观察，可见与理论值大小相符的两个条带，片段大小分别为750bp和5369bp(图2)，分别为hLOX基因片段和pET28a载体片段。　　2.3目的基因测序结果经双酶切初步鉴定的重组质粒送样进行DNA测序(北京三博远志生物有限公司)

8、。经过序列比对分析，结果表明，克隆序列与GeneBank所公布序列(GeneBankNM_002317)100%吻合。测序结果如图3(见封2)。　　3讨论　　LOX存在于人类、小鼠、大鼠、鸡、鱼等多种生物体中，广泛分布于多种组织器官，在心、肝、肺、子宫、卵巢、皮