家蚕性别决定相关基因Bmrbp1的克隆及原核表达

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1、家蚕性别决定相关基因蚴J『的克隆及原核表达特种经济动物饲养专业硕士研究生王子龙指导教师夏庆友(摘要)家蚕是重要的经济昆虫，更是经典遗传学研究的模式生物之一。许多研究证明雄蚕比雌蚕抗性好，体质强，叶丝转化率高，单养雄蚕可在不增加成本的前提下提高15％的产丝量，两且雄蚕丝纤度细、偏差小，丝质好，利于缫制高档生丝。因此，研究家蚕的性别决定机制，最终实现单养雄蚕可以有效地提高蚕业生产效率和经济效益。同时鳞翅目昆虫是主要的农林害虫，而家蚕是鳞翅曰昆虫的典型代表，解明家蚕的性别决定机制，以家蚕的性别决定机制为模式，有助于开展农林

2、害虫防治的研究。经典遗传学研究表明家蚕的性别dnW染色体上的一个强雌性决定因子(fern)决定，而到目前为Ikfe施没有鉴定出来，在家蚕中已经找到了果蝇性别决定级联末端基因dsx的同源体基因Bnzds,Y，与果蝇中的dsx*N以，Bmdsx的初级转录物在雌性和雄性中通过选择性拼接产生性别特异性成熟mRNA，编码雄特异性(BmDSZg，)和雌特异性(Bm3SXf)蛋自从丽决定家蚕性别的末端分化。但是aaldsx基因前体mRNA的选择性拼接机制与桑蝇向不同，果蝇中默认的拼接方式为雄特异性，在雌性中tra／tra-2F我活

3、了雌特异性拼按，而家蚕中Bmdsx默认的拼接方式为雌特异性的，雄性中由于受到一个阻遏物的作用而产生雄特异性拼接形式。rbpl是参与果蝇前体mRNA雌特异-眭拼接的一个重要拼接因子，本文对该基因在家蚕中的同源体8mrbpl进行T研究。本研究的内容与结果为：(1)利用家蚕EST数据克隆了果蝇Bmrbpl基因在家蚕中的同源体BmrbpI，其tnRNA全长820bp，编码142个氨基酸的蛋白，分子量为16．79kO．等电点为1158，N端含有一个RRM结构域，C端含有一个RS结构域，氨基酸序列比对分析表明Bmrbpl与rbp

4、l的氨基酸序列相似性达到77％，将rnRNA序列与家蚕基因组序列比较表明Bzarbpl由5个外显子和4个内含子组成，且所有的外显子／内含子拼接边界均符合经典的GT—AG规则。(2)为了研究Bmrbpl基因在家蚕雌雄各组织中的表达情况，以家蚕脂肪体(雌雄)、丝腺(雌雄)、中肠(雌雄)、体壁(雌雄)、头部(雌雄)、精巢、卵巢eDNA为模板进行RT—PCR扩增．RT—PCR结果表明BmTbpl基因在所检测的家蚕雌雄各组织中均有表达。为r进一步研究Bmrbpl基因在家蚕雌雄中是否有表达差异，根据已经克隆的mRNA序列殴计荧光

5、定量PCR珏南大学硕士学位论文引物和探针t以家蚕刚化蛹eDNA为模板，通过荧光定量PCR分析表明Bmrbpl在家蚕雌雄中并无表达差异，(3)以pET～28a(+)为表达载体，将Bmrbpl基因整个编码区亚克隆到pET-28a(+)发达载体构建成重组表达质粒，转化到BL21表达菌株，挑取单克隆先在24。C下振荡培养，当0D值达到06时加入终浓度为1枷的[PTG．在37℃240rpm／min诱导4小时，以转化有pET～28a(+)空载体的菌和未诱导的转化菌为对照．经SDS—PAGE电泳诱导菌出现约z1kD的目的蛋白带，说

6、明该基因编码的蛋白得到表达。关键词：性别决定原核表达拼接因子基因克隆CloningandprokaryoticexpressionoftheBombyxmoriBmrbpJ『gene，relatedtothesexdeterminationRaisingofSpecialeconomicanimalmasterWangzilongAdvisiorProf．Xiaqingyou(Abstract)Bombyxmoriisnotonlyariimportanteconomicinsect，butalsooneofthem

7、odelorganismsforclassicalgeneticsresearch．Manyresearchesshownthatmaleisbetterthanthefemaleinsuchcharacteristicsastheresistibility，health，ratiooftheleave-silktransformation，Rearing-male-onlycanbringabout15％increaseinthesilkproductionwithoutanincreaseincost，moreo

8、ver,thesilkproducedbymaleisbetterinqualitythanthefemale，therefore，researchthesexdeterminationmechanismintheBombyxmori，andfinallyrearchthegoaloftherearing-male—onlywilleffect