家蚕ociad2基因的克隆表达及其定位研究

《家蚕ociad2基因的克隆表达及其定位研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、浙江理．1：火学硕七学位论文家蚕OCIAD2基因的克隆表达及其定位研究摘要OCIA(ovariancancerimmuno．reactiveantigen)是一类具有跨膜结构的保守蛋白，它们的一个共同特征是含有OCIA超家族结构域。DC朋基因经选择性剪接后会产生多种同源异构体，编码的氨基酸序列稍微有差别。我们从本实验室构建的家蚕蛹eDNA文库中获得一条编码OCIAD2蛋白的cDNA序列(基因登录号为DQ443385)，我们将其命名为BmOClAD2(Bombyxmoriociadproteinisoform2)。该序列的ORF为645bp，编码214个氨基酸残基，基因组序列比对后发现该序列是由

2、5个外显子，4个内含子剪接而成。将推测的氨基酸序列进行同源性比对，发现该蛋白与其他物种的相关蛋白具有一定的同源性。扩增BmOCIAD2基因的ORF并克隆到表达载体pET．28“+)相应酶切位点上，成功·构建了重组表达质粒pET．28“+)．BmOCIAD2，经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导目的基因表达后，裂解菌体作SDS．PAGE分析，显示重组蛋白成功表达，主要以包涵体的形式存在。用尿素溶解包涵体后以亲和层析的方法纯化重组蛋白His．BmOCIAD2。FPLC反相柱进一步纯化重组蛋白，质谱鉴定测得该重组蛋白的分子量为27437

3、Da，与理论值相符，进一步证实了该蛋白表达的正确性。用纯化得到的重组蛋白为抗原免疫雄性新西兰白兔，制备了该重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA方法检测该抗血清(多克隆抗体)的效价可达到1：12800以上。利用多克隆抗体进行免疫印迹实验，结果表明BmOCIAD2蛋白在家蚕四个发育时期均有表达，蛹期表达量最高；在五龄幼虫的睾丸、马氏管、卵巢、头的表达量较高。利用荧光定量PCR技术对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期以及五龄幼虫各组织中BmOCIAD2的mRNA转录水平进行比较，分析发现在蛹期mRNA含量最高；在五龄幼虫的睾丸、马氏管、卵巢、气管、表皮、肠、头、脂肪体、丝腺中BmOCIAD2的mR

4、NA含量依次减少。用免疫荧光技术对BmOCIAD2蛋白进行亚细胞定位研究，结果显示BmOCIAD2蛋白主要存在于家蚕卵巢细胞系BmN细胞的细胞膜中。上述这些结果都为我们进一步研究BmOC认D2蛋白的相关功能提供了重要依据。关键词：家蚕；BmOCIAD2；表达分析；亚细胞定位I浙江理T大学硕+学位论文MolecularCloning，expressionandlocalizationanalysisofOCIAD2genefromSilkworm(BombyxmorOAbstractOCIA(ovariancancerimmuno-reactiveantigen)domainproteinsch

5、aracterizedbyOCIAmotifarenovelconservedproteinswithputativetransmembranedomains．TheOCIAtranscriptsaregeneratedbyalternativespliceandencodeslightlydifferentproteins．AcDNAsequenceencodingociadproteinisoform2wasfoundfromthecDNAlibraryconstructedbyOUtlaboratoryandwasnominatedBmOCIAD2(GenBankaccessionnum

6、berisDQ443385)．TheBmOCIAD2genecontains5exonsand4introns，andtheORFis645bpinlengthencodingaproteinof214aminoacidresidues．MultiplealignmentsandhomologyanalysisshowedthatBmOCIAD2sharesmorethan30％similaritywithotherinsects’relative‘proteins．InordertopreparethepolyclonalantibodyofBmOCIAD2，theORFofthegeneW

7、asclonedintopET-28a(+)vectorandtherecombinantproteinWasexpressedsuccessfullyinEcDliinductedbyIPTG．TheBmOCIAD2WasfusedwithHis．切gandpurifiedbyNi2+affinitychromatography．Themolecularweightofthisrecombina