家蚕30k蛋白基因克隆表达及其抗凋亡功能的研究

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1、浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：陆青玲≯断如金日期：2012年3月12Et浙江理工大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学

2、位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在不保密口√。学位论文作者签名：陆青玲日期：2012年3月12日年解密后使用本版权书。指导教师签名：于威叶、J日期：2012年3月12日本研究由浙江省自然科学基金项目(Y3090339)提供资助浙江理工大学硕士学位论文摘要家蚕30K载脂蛋白是家蚕幼虫血淋巴中主要的一群低密度脂蛋白，除载脂功能，还具有较强的抑制昆虫和哺乳动物细胞凋亡的活性。体内高血脂和自由基的堆积均可导致血管内皮细胞的凋亡，从而引起其功能发生异常。血管内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化形成过程中具

3、有至关重要的作用。由于家蚕30K蛋白兼具载脂功能和抗细胞凋亡的活性，推测其可能具有抑制人血管内皮细胞的凋亡从而保护血管内皮细胞的功能。因此，研究家蚕30K蛋白在血管内皮细胞凋亡过程中的作用极可能具有重要意义，进而可通过探索其药用价值，为防治和治疗动脉粥样硬化疾病提供新途径、新基础。家蚕30K蛋白基因在进化过程中产生很多种基因，编码的蛋白均具有相似的结构。本研究在前人研究的基础上，利用生物信息学工具，根据已报道的具有抗细胞凋亡功能的家蚕30K蛋白基因BmLp．c6(GenBank登录号：X54735)编码的氨基酸序列，与NCBI数据库进行同源性比对分析，获得两个与BmLp．c6

4、同源性较高的家蚕30K蛋白其基因序列分别为BmLip．19G1(GenBank登录号：AY568957)和BmLp．C12p(GenBank登录号：NM001101728)。然后利用RT．PCR技术从家蚕蛹中克隆了上述三条家蚕30K蛋白基因，并在家蚕Bac-to．Bac杆状病毒表达系统中进行大量融合表达、纯化。表达产物纯化后经SDS．PAGE可检测到纯度较高的、分子量大小约为30kD的目的蛋白条带。Westernblotting分析结果显示3种目的蛋白与融合表达标签6×His．tag单克隆抗体具有良好的特异性反应。利用自建的H202诱导人脐静脉内皮细胞(叫vEC)的体外损伤及

5、凋亡模型，研究家蚕30K蛋白对H202诱导的HUVEC凋亡的保护作用。MTT法检测结果显示：3种30K蛋白均可一定程度上增强HUVEC细胞的活力。对胞内8．异前列腺素F2a(8-Isoprostane)(氧化应激标志物)浓度检测结果显示：利用H202处理HUVEC，可明显增加胞内8-isoprostane的浓度，而3种30K蛋白均可显著降低胞内8-isoprostane的浓度，表明3种30K蛋白均可通过降低细胞内的氧化应激程度从而保护HUVEC。DNA片段化ELISA检测结果显示：3种30K蛋白均可降低HUVEC胞内DNA片段化程度，表明3种30K蛋白对H202诱导的HUVE

6、C细胞的凋亡均具有一定的抑制作用。流式细胞仪细胞凋亡检测结果也显示：3种浙江理工大学硕士学位论文30K蛋白均具有不同程度的降低HUVEC凋亡率的作用。综上所述，3种家蚕30K蛋白均可通过抑制H202诱导的细胞凋亡从而保护血管内皮细胞，本研究工作为今后进一步探索家蚕30K蛋白的药用价值奠定了基础。关键词：家蚕30K蛋白；Bac．to．Bac杆状病毒表达系统(BEVS)；人脐静脉内皮细胞(HUvEC)；细胞凋亡Il浙江理工大学硕士学位论文Cloning,ExpressionandAnti--apoptoticFunctionAnalysesof30KProteinsfromBom

7、byxmoriAbstract30Kapolipoproteinsareamajorgroupoflow-densitylipoproteininlarvaehemolymphofBombyxmori，besidesthebiologicalfunctionofearringlipoids，theyalsohaveproviouslyanti-apoptoticactivitiesininsectcellsandmammaliancells．Highbloodcholesterolandfleeradi