家蚕ranbp5-like基因克隆表达及功能的分析

《家蚕ranbp5-like基因克隆表达及功能的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、浙江理工大学硕士学位论文摘要RanBPs(Ranbindingproteins)是细胞内一类蛋白的总称，其作用是调节Ran的作用在细胞内得以正常的发挥。Ran是一种主要分布于细胞核内的小分子蛋白质，20世纪90年代被发现并证实具有GTP酶活性，通过分解GTP，调解下游的效应分子，达到调节细胞生命活动的目的。Ran的功能多种多样，有许多证据表明Ran及其结合蛋白参与细胞周期中的多个过程。Ran于近几年来逐步被确认为一种重要的细胞增殖调控因子。我们从本实验室构建的家蚕蛹eDNA文库中获得一条cDNA序列，全长为1384bp，基因登录号为DN237073，

2、其中ORF为945bp，编码314个氨基酸，预测分子量为35kD，等电点为4．62。将该推测的氨基酸序列进行同源性(BlastP)比对，发现其与冈比亚按蚊(XP310308)，谷蛀虫(XP967428)，果蝇(XP001998194)，小鼠(BAE36521)，人(000410)中的Ranbindingprotein5具有同源性，其同源性分别为49％，49％，47％，43％，42％，它们可能存在功能上的相似性。我们将家蚕中的该蛋白命名为RanBP5．1ike蛋白。为了研究该蛋白的功能，我们通过在上下游引物中分别加入BarnHI和XhoI酶切位点，经P

3、CR扩增后，将该基因克隆到载体pET-28a中。PCR及双酶切鉴定重组成功后转化感受态细胞E．coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达后SDS．PAGE检测，与阴性对照相比在38kD处有一特异性条带，与预期结果一致。重组蛋白以可溶的形式存在于上清中，经镍柱亲和纯化后，得到纯化的RanBP5一like重组蛋白。纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔后制备得到多克隆抗体，经ELISA检测，抗体效价可达1：16000以上。利用该抗体通过Westernblotting技术检测家蚕各个发育阶段和五龄蚕各个组织中RanBP5．1ike蛋白的表达和分布，结果显示蛋白

4、表达水平在蛹和精巢中的表达量最高，此外我们还利用荧光定量PCR的方法，对家蚕各个时期及五龄蚕各个组织中RanBP5一like蛋白mRNA的量进行分析发现结果和Westernblotting的结果相符。利用抗体免疫荧光标记技术我们对该蛋白在家蚕Bm5细胞中进行定位，观察到红色荧光主要分布在细胞质中。关键词家蚕；Ran蛋白；原核表达；纯化；Westernblotting；组织定位；亚细胞定位；荧光定量PCR浙江理工大学硕士学位论文AbstractRanBPs(Ranbindingproteins)isnamedfromRan(Ras—likenuclea

5、rprotein)whichcallinteractwithRanBPs．RanBPsareagroupofdifferentproteins．Ranexistedmainlyinthenucleus．Itwasfoundin1990sandhasafunctionofGTPasewhocalldecomposeGTPandregulatethecellularprocessesbyfunction、^，itIlthefollowingacters．Ranhasalotoffunctions，manyevidenceindicatedmatRanan

6、dRanBPsplayaroleincellularprocesses．RecentlyRanisaffmnedafactorregulatingandcontrollingthecellularprocesses．AneDNAsequencefoundfromtheeDNAlibraryconstructedbyourlaboratorycontains1384bp，GenBankaccessionnumberisDN237073．TheORFis945bpandencodesaproteinof314aminoacidresidues．Thepr

7、edictedproteinhasamolecularweightof35kDandthetheoreticalpIliesat4．26．Contrasting、析motherproteinsinAnophelesgambiaeslr(XP一310308)，Triboliumcastaneum(XP一967428)，Drosophilamojavensis(XP一001998194)，Musmusculus(BAE36521)andHomosapiens(000410)，wefoundthattheyhavehighsimilarities．Thes

8、imilaritiesare49％，49％，47％，43％，42％．Maybetheyhavesimilar