川芎comt基因序列的克隆、分析、表达及功能鉴定

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1、学位论文＿ＭＡＳＴＥＲＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＴ＾＾＾翅目、：川苟ＣＯＭＴ基因序列的克隆分析、表达及功能鉴定、，＇，丨：慮学位类别：工程硕士士＿＿学科专业：生物工程研允生：—指导老师：三：周嘉裕副教授〒式：国内图书分类号：Ｑ７８密级公开．．国际图书分类号：５７西南交通大学研究生学位论文川昔ＣＯＭＴ基因序列的克隆、分析、表达及功能鉴定年级一二：二零姓名：张赶学位级别：工程硕士专业：生物工程指导老师：周嘉裕副教授

2、二零一五年五月ＣｌａｓｓｉｆｉｅｄＩｎｄｅｘ：Ｕ．Ｄ．Ｃ：ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｓｔｅｒＤｅｒｅｅＴｈｅｓｉｓｇＧｒａｄｅ：２０１２Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＺｈａｎｇＧａｎｒｅｅｏｒ：ａｎＡｃａｄｅｍｉｃＤｅｇＡｐｐｌｉｅｄｆＭｓｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｇＳｅｃｉａｌｉｔ：ＢｉｏｌｏｉｃａｌＥｎｉｎｅｅｒｉｎｐｙｇｇｇＳｕｅｒｖｉｓｏｒ：ＡｓｓｏｃｉａｔｅＰｒｏｆ．ＺｈｏｕＪｉａｕｐｙＭａｙ，

3、２０１５西南交通大学学位论文版权使用授权书、本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留并。向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１．□，在保密年解密后适用本授权书；２．不保密Ｂ／使用本授权书。＂＂（请在以上方框内打ｖ）学位论文作者签名：：＊封指导老师签名ｙ曰期：西

4、南交通大学硕士学位论文主要工作（贡献）声明本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下：１．根据川考根莲转录组中的部分序列，通过ＲＡＣＥ技术克隆了川弯咖啡酸３－Ｃ０ＭＴ）的全长ｃＤＮＡ序列ｃ氧甲基转移酶（Ｃ４，该ＤＮＡ序列长１１７１ｂｐ，包括０８９ｂ３６２ａａ－Ｃ０ＭＴ１ｐ的ＯＲＦ，编码的蛋白。通过生物信息学方法分析了Ｃ４蛋白的理化性质－Ｃ０ＭＴ与其他物ＣＯＭＴ。同源比对分析表明，川弯Ｃ４种的同源性较高－Ｃ０ＭＴ含有７个，Ｃ４保守的基序，催化的关键氨基酸残基为－－－－ｓ２６８ｓ－Ｈｉ

5、，Ａｐ２６９，Ｇｌｕ２９６，Ｇｌｕ３２８。系统进化树分析发现川弯Ｃ４Ｃ０ＭＴ蛋白与同为伞形科植物的大阿米序关系最近一，归为类，而与原核生物中的香蕉－枯萎病菌关系最远。预测了Ｃ４Ｃ０ＭＴ蛋白二级结构同时根据同源建模法构建了蛋白的三维模型。－２．构建了ＣＯＭＴ８ａ重组质粒ＢＬ２ｐＥＴ２，转入１菌株中，成功诱导表达出与预一致的可溶性重组蛋白期产物分子量大小。对重组菌株的表达条件进行了优＋化，确定了菌株表达的最佳温度、最佳ＩＰＴＧ浓度、最佳诱导时间。通过Ｎｉ２亲和柱纯化出重组蛋

6、白。在体外成功进行了ＣＯＭＴ的催化反应，并通过高效液相色谱检测酶活性ｉＨＮＭＲ。反应产物经纯化后，经鉴定为阿魏酸。确定了°酶的最适温度为３７Ｃ，最适ｐＨ为７。通过定点突变法，对蛋白预测的关键催化残基进行了验证。：所呈交的学位论文本人郑重声明，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明。本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。

7、学位论文作者签名：辦曰期：２＾Ｌ／１，西南交通大学硕士研究生学位论文第Ｉ页摘要一川弯｛ＬｉｇｕｓｔｉｃｕｍｃｈｕａｍｉｏｎｇＨｏｒｔ）为我国中医传统药物中的种常用药物，有活血行气、祛风止痛的功效。其中阿魏酸为其指标成分和主要活性成分。阿魏酸的生物合成途径中以咖啡酸甲基化生成阿魏酸为主要调控步骤－－，其中咖啡酸０甲基转移酶（ＣＯＭＴ）在其中起着很重要的作用。一ＯＭＴ序列从川夸转录组中蹄选出了条同源性较高的Ｃ。通过ＲＡＣＥ技术扩增出－序列的全长序列１１７１ｂ３６２ａ

8、ａＣＯＭＴ（ＧｅｎＢａｎｋ。序列全长ｐ，翻译的蛋白，命名为Ｃ４ａｃｃｅ－ｓｓｉｏｎｎｏ．ＫＲｌ０６２０６）。蛋白基本性质分析结果显示，Ｃ４Ｃ０ＭＴ蛋白分子量为３９．９３２ｋＤａ，等电点为５．９５。对其蛋白亲疏水、信号肽、亚细胞定位分析显示，蛋白为偏亲水性蛋白，亚细胞定位可能在细胞质。通过与其他８条已知ＣＯＭＴ氨，无信号肽Ｃ：ＯＭＴ蛋白保守的７个基序基酸序列进行序列比对