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时间:2019-05-13
《山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、东北农业大学硕士学位论文山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建姓名:张莉申请学位级别:硕士专业:基础兽医学指导教师:李庆章2003.6.1摘要当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的,由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染,影响了FSH的广泛应用。用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH,降低生产费用,这对畜牧业生产具有重要意义。本试验是从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段,分别获得长为360bp的山
2、羊FSH-a亚基DNA片段和长为390bp的山羊FSH.B亚基DNA片段,与预期的目的基因片8L大d,—致。将它们分了在同一种内,甚至在所有的哺乳动物中FSH.a亚基是极为保守的;而FSH—B亚基尽管具有种属特异性,但也是相当保守的。将所得的山羊FSH-a、B亚基基因分别用加相应限制性内切酶酶切位点的引物大量扩增,回收后与pMD18-T连接,筛选出阳性重组子,大量双酶切回收获得带粘性末端的山羊FSH.a、B亚基基因,将它们分别与同两个酶大量双酶切回收获得的带粘性末端的PF质粒进行连接,筛选阳性重组子。依此方法分别构建了FSH单
3、亚基真核表达载体gr'SH-2-PF、gFSH-B-PF和FSH双亚基真核表达载体庐sH-a—B-PF、dFSH—o-gFSHB,PF。户7一本研究首次进行了山羊FSH的基因克隆、序列分析及表达载体构建方面的探索,填补了国内外重组山羊FSH基础研究的空白,为今后重组山羊FSH的大量生产应用提供了理论基础和实验依据。关键词山恙卵泡刺激素;基因克隆;序列分析;表达载体构建i/VAbstractTheproductsoffolliclestimulatinghormone(FS}nusedinanimalhusbandryafeal
4、lexl/'ltc把dfromthepitui倒esofbovine.goat,pigand咖otheranimals.11"lackoffalandlowpurityofthiskindofFSHlimitilsextensiveapplication.ByⅡ"rtleallsofgeneengineering,largequantityandhighpurityFSHcanbeproducedandtheproductionexpenditurealSOc∞bereduced.whichisim【portanttoanim
5、alhusbandry.TotalRNAwasextractedfrompituitaryofnewbutcheredfemalegoatforFSH_旺and13subuni_tgenes.eDNAⅥ雠synlhesizedbyRT-PCRn塌d由M】srespectivelyandtheseeDNAwe∞used∞templatesinPCRamplifications..nlePCRproductsWere360t,pand390bpwhichjustwerethesamelengthofthepredictedgoat
6、FSH-aandBsubunitgenes.Theywerecloned幻pMD18-Trespectivelyandselectedtwopositiverecombinamsatr'dndorfltoanalysistheirsequencesrespectively,andcomparedtheirgenesandaminoacidswithsomeothermamma】s.T1】eresultsshowedthatthegenesandaminoacidsofgoatFSH-aandBsublmitsaUhavever
7、yhighhomologywithothern墙mInalsandtheirhomologyalle)【c∞d80%.TheseresultsprovedthraFSH·nsubuni^hashighconservationamongmammalsandFSH-13subunitisalsoquiteconservativeamongmammalsalthoughitshowsspeciesspecifieity.GoatFSH-Qand13subunitgenes、㈣reamplifiedrespectivelybythen
8、ewprimerswhichhadthecorrespondingrestrictionenzymes.11砖PCRproductswereplaifiedandlinkedwithpMD18-Tvectorrespectively.Thepositivereeombinan
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