山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建

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1、东北农业大学硕士学位论文山羊卵泡刺激素基因的克隆、序列分析及表达载体构建姓名：张莉申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：李庆章2003.6.1摘要当前畜牧业生产中所使用的卵泡刺激素(FSH)产品都是从牛、羊、猪等家畜的脑垂体中直接提取的，由于材料来源有限、纯度差且常有其它激素的污染，影响了FSH的广泛应用。用基因工程方法可大量生产高纯度的FSH，降低生产费用，这对畜牧业生产具有重要意义。本试验是从新屠宰的母山羊脑垂体中提取总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板，PCR扩增目的基因片段，分别获得长为360bp的山

2、羊FSH-a亚基DNA片段和长为390bp的山羊FSH．B亚基DNA片段，与预期的目的基因片8L大d,—致。将它们分了在同一种内，甚至在所有的哺乳动物中FSH．a亚基是极为保守的；而FSH—B亚基尽管具有种属特异性，但也是相当保守的。将所得的山羊FSH-a、B亚基基因分别用加相应限制性内切酶酶切位点的引物大量扩增，回收后与pMD18-T连接，筛选出阳性重组子，大量双酶切回收获得带粘性末端的山羊FSH．a、B亚基基因，将它们分别与同两个酶大量双酶切回收获得的带粘性末端的PF质粒进行连接，筛选阳性重组子。依此方法分别构建了FSH单

3、亚基真核表达载体gr'SH-2-PF、gFSH-B-PF和FSH双亚基真核表达载体庐sH-a—B-PF、dFSH—o-gFSHB，PF。户7一本研究首次进行了山羊FSH的基因克隆、序列分析及表达载体构建方面的探索，填补了国内外重组山羊FSH基础研究的空白，为今后重组山羊FSH的大量生产应用提供了理论基础和实验依据。关键词山恙卵泡刺激素；基因克隆；序列分析；表达载体构建i／VAbstractTheproductsoffolliclestimulatinghormone(FS}nusedinanimalhusbandryafeal

4、lexl／'ltc把dfromthepitui倒esofbovine．goat,pigand咖otheranimals．11"lackoffalandlowpurityofthiskindofFSHlimitilsextensiveapplication．ByⅡ"rtleallsofgeneengineering,largequantityandhighpurityFSHcanbeproducedandtheproductionexpenditurealSOc∞bereduced．whichisim【portanttoanim

5、alhusbandry．TotalRNAwasextractedfrompituitaryofnewbutcheredfemalegoatforFSH_旺and13subuni_tgenes．eDNAⅥ雠synlhesizedbyRT-PCRn塌d由M】srespectivelyandtheseeDNAwe∞used∞templatesinPCRamplifications．．nlePCRproductsWere360t,pand390bpwhichjustwerethesamelengthofthepredictedgoat

6、FSH-aandBsubunitgenes．Theywerecloned幻pMD18-Trespectivelyandselectedtwopositiverecombinamsatr'dndorfltoanalysistheirsequencesrespectively,andcomparedtheirgenesandaminoacidswithsomeothermamma】s．T1】eresultsshowedthatthegenesandaminoacidsofgoatFSH-aandBsublmitsaUhavever

7、yhighhomologywithothern墙mInalsandtheirhomologyalle)【c∞d80％．TheseresultsprovedthraFSH·nsubuni^hashighconservationamongmammalsandFSH-13subunitisalsoquiteconservativeamongmammalsalthoughitshowsspeciesspecifieity．GoatFSH-Qand13subunitgenes、㈣reamplifiedrespectivelybythen

8、ewprimerswhichhadthecorrespondingrestrictionenzymes．11砖PCRproductswereplaifiedandlinkedwithpMD18-Tvectorrespectively．Thepositivereeombinan