绒山羊fgf5基因的序列分析与其敲除载体构建

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1、摘要成纤维细胞生长因子5(FibroblastGrowthFactor-5，FGF5)在中枢神经系统和皮肤中表达，在皮肤中抑制毛囊由兴盛期向休止期转化，FGF5敲除小鼠的被毛明显长于对照。其他动物如狗、猫和兔子的研究表明FGF5的变异与毛被的长短有关。关于山羊FGF5的变异和毛被长短的关系还不明确。本文针对山羊FGF5基因进行了研究，取得了如下结果：选用阿尔巴斯绒山羊为材料，通过PCR扩增、克隆FGF5启动子、第一外显子、第一内含子，测序后拼接成全长为9483bp的序列，其中第一外显子为364bp，第一内含子为7809bp。为后续的多态性分析和

2、敲除载体的构建奠定了基础。将绒山羊FGF5第一内含子序列和GenBank中3个人的基因组进行Blastn比对发现，人和绒山羊FGF5第一内含子呈高度的同线性同源序列，有3个高同源区，同源性分别为69%、70%和75%；有两个低同源区，第一个非同源区位于1545bp-2368bp和1545bp-2788bp之间，第二个非同源区位于6799bp-6860bp之间；与牛FGF5第一内含子序列相比，牛FGF5基因的第一内含子要比绒山羊的序列多出两部分，位于4728bp-4729bp之间的274bp和位于5378bp-5379bp之间的1365bp片段。

3、通过PCR产物直接测序，结合已经发布的羊cDNA序列对阿尔巴斯绒山羊、奶山羊、蒙古羊（绵羊）的成纤维细胞生长因子5（FGF5）基因的3个外显子进行变异分析，如奶山羊和蒙古羊在FGF5基因距翻译起始密码子(ATG)273位点都存在T和C的杂合位点，绒山羊为C。该变异未引起山羊FGF5氨基酸序列的改变，绒山羊和蒙古羊比较有4个核苷酸发生变异。将三个品种的FGF5基因外显子序列预测成氨基酸序列，绵羊和山羊距翻译起始密码子(ATG)161位点有一处不同，绒山羊和奶山羊为A(丙氨酸)，密码子为GCG；而蒙古羊为V(缬氨酸)，密码子为GTG。将绒山羊FGF

4、5启动子至第一外显子1.6kb片段插入到敲除载体pLox的XbaⅠ和ClaⅠ位点，构建成中间敲除载体pLox5；再把山羊FGF5第一内含子4.5kb片段插入到pLox5的NotⅠ位点，筛选符合插入方向的载体命名为pLox5-33，经测序分析证明敲除载体完全符合预期设计。为后期获得敲除FGF5基因的绒山羊个体奠定了基础。关键词：FGF5；PCR；山羊；绵羊；多态性；敲除载体；基因敲除PolymorphismAnalysisinFGF5GeneofCashmereGoatandConstructionofKnock-outVectorAbstrac

5、tFGF5isoneofmemberoftheFGFsuperfamily.Itisexpressedincentralnervoussystemandskin,FGF5knockoutmiceweresignificantlylongerhairthanthecontrolmice.Otheranimalssuchasdogs,catsandrabbitsshowthatthevariationsFGF5haverelationshipwithlengthofhair.VariationonthegoatFGF5andtherelations

6、hipbetweenthelengthsofhairisnotclear.Inthisresearch,goatFGF5geneswerestudied,takenthefollowingresults:TheexperimentsubjectschosedtheArbascashmeregoat,throughPCR,DNAcloningandsequencinganalysis,includedtheFGF5promoter,firstexon,firstintronandsecondexonbeassembledintoa9483bpsi

7、zeofDNAfragment,wherethefirstexonis477bp,thefirstintronwas7809bp,forthefurtherresearehDNAsequencevariationandConstructionofKnock-outVector.ThefirstintronsequencesofgoatFGF5genecomparewithGenBankdatabasebyBlastn.Theresultsshowedthat:itwashighlysyntenyhomologouswiththeotherani

8、mal’sFGF5genesequence,therearethreehighhomologyregionswere69%,70%and75%;the