解淀粉芽孢杆菌pyrR基因敲除载体的构建.pdf

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1、南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2015．46(8)：1339—1344ISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nf．yxb．coinDOI：10．39696：issn．2095-1191．2015．08．1339解淀粉芽孢杆菌]pyrR基因敲除载体的构建吴庆，刘慧燕，方海田+，何建国，贺晓光，王梦娇，于丽男(宁夏大学农学院，银川750021)摘要：【目的】构建用于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)py

2、rR基因敲除的温敏型敲除载体，为研究pyrR蛋白缺失对胞苷合成的影响奠定基础。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物，以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板，利用PCR分别扩增pyrg基因的上游同源序列和下游同源序列，再定向克隆至含卡那抗性基因的pKSl温敏型载体上，构建敲除载体pKSl-pyrR。【结果】经特异性引物对pyrR-S1／pyrR．A17fllpyrR．S2／pyrR．A2扩增，获得解淀粉芽孢杆菌目的DNA片段pyrR．up和pyrR．down，大小约500bp；目的片段经克隆载体p

3、MDl9．T连接、Transl．T1转化，获得的重组质粒分别以KpnI／HindIII、PstI／NotI双酶切鉴定和测序后，可获得大小约500bp的上、下游克隆载体T-pyrR．up和IT-pyrR．down。上游克隆载体T-pyrR．up经_KpnI与H／ridIII双酶切及T4DNA连接、Transl．T1转化后，进行重组载体检测和质粒双酶切鉴定，得到大小分别为433、5064bp的片段，与连接长度一致，构建获得带标记基因的重组载体pKSl-pyrR．up。采用PstI和NotI对T-pyrR．d

4、own和pKSl-pyrR．up同时进行双酶切，经连接、转化、双酶切鉴定后，得到两条长度分别为446和5497bp的片段，与连接前长度一致，证明pyrR的上、下游同源臂已正确插入到pKSl载体中，获得敲除载体pKSl-pyrR。【结论】构建的解淀粉芽孢杆]基pyrR基因敲除载体pKSl-pyrR可用于研究敲除pyrR基因及pyrR蛋白缺失对胞苷过量合成的影响。关键词：解淀粉芽孢杆菌；pyrR基因；基因敲除；温敏型敲除载体；胞苷中图分类号：Q786文献标志码：A文章编号：2095～1191(2015)08

5、—1339—06ConstructionofpyrRgeneknock-outvectorforBacillusamyloliquefacienswuQing，LIUHui-yan，FANGHai-tian+，HEJian-guo，HEXiao-guang，WANGMeng-jiao，YULi-nan(SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China)Abstract：【Objective】，I’}lepresentstudywasco

6、nductedtoconstructatemperature—sensitiveknock—outvectorforpyrRgeneinBatillusamyjoliquefaeiensinordertolaythefoundationforstudyingtheeffectsofeyrRproteindeftciencyoncyti—dinesynthesis．【Method】rrheprimerswithrestrictedendonucleaseslocusweredesignedfirsdy，f

7、ollowedbyamplifyingtheupstreamanddownstreamarms’sequencesofpyrRgeneinB．amyloliquefaciensbyusinggenomeDNAastemplateandPCRmethod．Then．theamplifiedfragmentswereclonedintothetemperaturesensitivevectorpKSltoconstructtempera-turesensitiveknock-outvectorpKSl-py

8、rRcontainingupstreamanddownstreamhomologoussequencesofpyrRgene，andkanamyeingene．【Result】TIleobtainedtargetfragmentsofpyrR-upandpyrR—downinB．amyloliquefacienswereabout500bpinlengthafteramplifiedwithspecificprimerpairpyrR-Sl