解淀粉芽孢杆菌cqba03菌株基因组文库的构建和抗菌相关机制研究

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1、解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组文库的构建和抗菌相关机制研究重庆大学博士学位论文学生姓名：陈玉龙陈玉龙指导教师：殷幼平教授专业：植物学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一五年十一月ConstructionofAGenomicLibraryofBacillusAmyloliquefaciensCQBA03StrainandStudyonMechanismofAntimicrobialActivityAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfo

2、rtheDoctor’sDegreeofScienceByChenYulongSupervisedbyProf.YinYoupingSpecialty:BotanyShoolofLifeSciencesofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaNovember,2015中文摘要摘要革兰氏阴性细菌导致的植物细菌性病害超过250种，此类细菌性植物病害造成大量的植物减产和经济损失。而柑橘溃疡病(CitrusBagtedalCankerDisease，CBCD)是其中一种重大植物病害，在超过30个国家广泛分布，该病能够造成重大的

3、柑橘业损失。在疫区，传统的柑橘溃疡病防治方法大多采用铜制剂和农用抗生素，不仅效果不佳，反而造成大量的红蜘蛛泛滥和抗生素与重金属离子的超标；对于严重发病的柑橘溃疡病感染植株，一般只能采取焚烧的方式阻止其扩撒。芽孢杆菌作为一类常用的具有生物防治作用的菌株，对植物病原菌和柑橘溃疡病有良好的防治效果。对其抗菌基因和抗菌物质的筛选和研究，有利于阐述生物防治机制和高效生防菌的筛选应用。本研究以解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株（BacillusamyloliquefaciensCQBA03）和柑橘溃疡病病原菌(Xanthomonascitrussubsp.citrus

4、.Xcc)为研究对象，通过构建Fosmid文库的方式，构建解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组文库克隆。对其文库进行诱导、定向筛选，获得抗柑橘溃疡病病原菌的克隆。经克隆、测序、生物信息学分析、纯化、表达抗菌基因，揭示了该菌株相关抗菌物质的代谢通路并获得了一种新的分泌型抗菌蛋白。同时以解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株外分泌的D型氨基酸入手，研究了D型氨基酸对柑橘溃疡病病原菌的变形、致死作用，并且测定了实验室条件下，D型氨基酸对柑橘溃疡病的防、治效果。研究为阐述CQBA03菌株抗菌机制和应用提供了理论依据。①解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组Fosmid文

5、库的构建建立了解淀粉芽孢杆菌CQBA03菌株基因组Fosmid文库，共获得约2,3000个文库克隆。文库容量920Mb，本文库容量在CQBA03菌株基因组244~263倍左右,平均容量是解淀粉芽孢杆菌基因组的256倍。随机外源插入片段为36kb~50kb,平均大小为45kb,其中约40.8%的插入片段大小在31kb到35kb之间,约36.0%的插入片段在35kb到40kb之间。空载率小于1.5%。②抗溃疡病病菌克隆的获得和分析1)通过在牛奶平板筛选培养基上，4℃条件下诱导，从10，000个文库克隆中，筛选出了66个具有外分泌蛋白酶的文库克隆。从中我们筛

6、选了1株具有最强外分泌蛋白酶功能的抗柑橘溃疡病克隆子进行DNA测序。2)将克隆通过454测序后，得到长度为58,785bp的序列，GC=49.13%。经生物信息学分析，预测到344个开放阅读框。对比后发现，与已知基因相似的ORF有75个，其中25个基因与抗微生物有关，生理生化相关酶类26个，昆虫毒性蛋I重庆大学博士学位论文白1个(Insecticidaltoxindomainprotein)；其余23个为功能未知的蛋白质，占总已知序列75个的30%。对所得序列进行代谢通路分析得到24条完整的代谢通路，其中与抗菌相关的通路包括酮的合成与降解（Synthe

7、sisanddegradationofketonebodies），并首次从解淀粉芽孢杆菌基因组获得12、14和16三种大环内酯类抗生素生物合成（Biosynthesisof12、14and16-memberedmacrolides）通路。③抗菌基因的获得、表达、纯化1）通过序列分析，筛选出7个可能与抗菌相关的基因序列，经PCR扩增和连接，克隆于PMD19T载体并进行了抗柑橘溃疡病功能测定。从中筛选出一个抗柑橘溃疡病的小肽基因，该基因长度132bp(登录号BankIt1690482)，编码一个43AA的小肽：其信号位点27-28AA，分子量（Molecu

8、larweight）4772Da，等电点（pI）6.38。通过比对，该基因与线性短杆菌肽酶的缩