产乙醇杆菌属功能基因克隆表达及基因敲除载体构建

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1、Classifiedindex:X703U.D.C.:628.35DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringCLONING,EXPRESSIONANDGENE-REPLACEMENTVECTORCONSTRUCTIONOFFUNCTIONALGENESFROMETHANOLIGENESCandidate:LinHailongSupervisor:Prof.RenNanqiAcademicDegreeAppliedfor:DoctorofEngineeringSpeciality:EnvironmentalEngineeringAffiliat

2、ion:SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineeringDateofDefence:March,2008Degree-Conferring-Institution:HarbinInstituteofTechnology摘要摘要有机废水发酵法生物制氢技术具有能源和环保的双重功效，已经成为环境生物技术和新能源领域研究的热点之一。但是该技术目前还处于研发阶段，如何提高厌氧发酵产氢细菌的产氢能力已成为实现该技术工业化进程中所面临的关键性问题。针对这一关键性问题，依据现有的生物产氢代谢理论和代谢工程调控理论，通过对现有高效产氢菌进行代谢工程改造，构建更高效的产

3、氢基因工程菌，成为实现其产业化非常有潜力的策略之一。本论文以乙醇发酵高效产氢菌EthanoligenensharbinenseB49为出发菌株，克隆、表达与产氢相关的、控制末端代谢产物生成的关键酶基因，如对丙酮酸产氢途径和NADH产氢途径有影响的L-乳酸脱氢酶基因，对NADH产氢途径有影响的乙醛乙醇脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因，对反应中酸碱度有影响的乙酸激酶基因。并分别构建了用于基因敲除目的的置换型基因敲除载体。本项研究克隆了涉及乙醇发酵和产氢发酵的重要基因，并构建了相应的基因敲除载体，这些资源的获得将在揭示乙醇发酵机理、乙醇发酵产氢机理、等方面有重要意义，也是系统、多方位地研究发酵法生物制

4、氢菌种代谢工程研究的开始。利用简并引物PCR和cassettePCR技术相结合的方法克隆了控制丙酮酸生成乳酸的L-乳酸脱氢酶基因（L-ldh）的完整DNA序列。L-ldh片段DNA长2490bp，其在GenBank上的注册号为DQ179104。编码区DNA长951bp，编码316aa，编码蛋白的分子量为34.23kD，理论等电点为6.09。SignalP预测表明L-ldh氨基酸序列的N端21个氨基酸为信号肽，说明L-ldh可能为分泌型酶。同时，将克隆得到的L-ldh基因在E.coli中异源表达。以获得的序列为基础，采用pET-22b和pJIR751质粒构建了以卡那霉素抗性基因为报告基因的L

5、-ldh置换型基因敲除载体，其中长臂长1400bp，短臂长650bp。利用简并引物PCR和CassettePCR技术相结合的方法克隆了控制乙酰辅酶A生成乙酸的乙酸激酶基因（ack）的完整DNA序列。Ack片段DNA长2980bp，其在GenBank上的注册号为DQ179102。编码区DNA长1200bp，编码399aa，编码蛋白的分子量为43.22kD，理论等电点为5.93。同时，将克隆得到的ack基因在E.coli中异源表达。以获得的序列为基础，采用pET-22b构建了以氯霉素抗性基因为报告基因的乙酸激酶基因置换型基因敲除载体，其中长臂长1700bp，短臂长690bp。-I-哈尔滨工业大

6、学工学博士学位论文利用简并引物PCR和cassettePCR技术相结合的方法克隆了控制乙醇生成的乙醇脱氢酶（adh）、乙醛乙醇脱氢酶（adhE）和氧化还原转录抑制因子Rex（Rex）基因。AdhE和Rex基因DNA片段长3747bp长，其在GenBank上的注册号为DQ179103。Adh基因DNA片段长1902bp，其在GenBank上的注册号为EU196512。AdhE编码区DNA长2616bp，编码871aa，编码蛋白的分子量为95.47kD，理论等电点为6.16。Rex编码区DNA长657bp，编码218aa，编码蛋白的分子量为24.5kD，理论等电点为7.2。Adh编码区DNA长

7、1101bp，编码366aa，编码蛋白的分子量为39.71kD，理论等电点为5.93。同时，将克隆得到的adhE基因在E.coli中异源表达。以获得的序列为基础，采用pET-22b和pJIR751质粒构建了以氯霉素抗性基因为报告基因的adhE置换型基因敲除载体，其中长臂长2000bp，短臂长1200bp。关键词L-乳酸脱氢酶基因；乙醛乙醇脱氢酶基因；乙醇脱氢酶基因；乙酸激酶基因；氧化还原转录抑制因子；Ethanolige