不同序列型ail基因克隆菌株的构建与其粘附侵袭性分析

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1、摘要1．选择分别代表3种不同序列型口f，基因的致病性耶尔森菌，通过PCR扩增获得基因序列后，构建pMDl8．T-ail重组质粒，分别转入大肠杆菌JMl09和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌Y40。挑选克隆菌株进行特异性PCR和测序鉴定。2．用经鉴定正确连接的阳性克隆菌株，对HEp．2细胞和HT．29细胞做体外粘附侵袭实验。计算各个克隆菌株的粘附侵袭效率，筛选粘附侵袭表型阳性克隆菌株，并比较不同序列型克隆菌株在粘附侵袭功能上是否存在差异，尤其关注新发现A3序列型ail基因粘附侵袭功能的改变。结果1．经PCR扩增、测序鉴定，成功构建重组质粒pMDl8．T-ail，转化得到重组菌株JMl

2、09／pMDl8-T-ail和Y40／pMDl8一T-ail。2．RT-PCR结果显示，不同序列型口f，基因在各种克隆菌株中成功转录。3．体外粘附侵袭实验显示，对小鼠高致病株Ye92010(1b／O：8)代表的A2型大肠杆菌克隆菌株能够稳定表达粘附侵袭功能，而对小鼠低致病株HA8629(2／O：9)代表的A1型大肠杆菌克隆菌株和IE419(2／0：9)代表的新发现A3型大肠杆菌克隆菌株均只有l株显示粘附侵袭功能；3种类型大肠杆菌克隆菌株对两种组织细胞的粘附侵袭作用无系别差异。4．显微镜下观察3种粘附侵袭阳性的大肠杆菌克隆菌株与HEp．2细胞作用后的染色图片，结果显示：与致病性

3、小肠结肠炎耶尔森菌相比，克隆菌株沿细胞排列的形态出现改变，呈点状、散在分布。5．3种类型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌口f，基因克隆菌株均不表现粘附侵袭的功能，并且在获得ail基因后，其本身固有的非特异性粘附效率出现了下降。’结论1．成功构建不同序列型口ff基因的大肠杆菌克隆菌株和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌克隆菌株。2．通过体外粘附侵袭实验获得含不同序列型口f，基因且粘附侵袭表型阳性的大肠杆菌克隆菌株。Ⅱ摘要3．口f，基因序列多态性对不同生物血清型致病性菌株的致病毒力可产生影响：非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中口fZ基因的缺失有可能是其致病毒力缺失的原因之一。4．在本次研究中，A3型

4、口f，基因克隆菌株与Al型口玎基因克隆菌株在粘附侵袭功能上不存在差异。关键词：小肠结肠炎耶尔森菌口f7基因序列多态性粘附侵袭IIIABSTRACTYersiniaenterocoliticaWaSwidelydistributedinthenaturalworld，WaSoneofthefewintestinalpathogenicbacteriawhichcouldgrowinrefrigeratedtemperature．Italsowasanimportantfoodbornepathogenicbacteria；andhadalreadybeenlistedasaco

5、nventionaldetectionprojectofimportandexportfoodinmanycontries．Yersiniaenterocoliticawasobviouslypathogenictohumansandanimals．InfectionofYersiniaenterocoliticacouldmanifestaseriesofvarioussyndromes，besidesgastrointestinalsymptoms，stillcouldcausediseasesincardiovascularsystem，respiratorysyste

6、m，boneconnectivetissue，evenleadtodeathbysystemicdiseaseandsEpticemia．Thecommonfeatureofpathogenicbacteriawasthebreakthroughtothedefensemechanismofhost，whichwascloselyrelatedwiththesurvivalfeatures(intracellularsurvival)ofbacterium．Invasionandintracellularsurvivalwerethoughttobeimportantaspe

7、ctsofthevirulenceofmanypathogenicbacteria．Theabilitytoinvade‘eucaryoticcellsWasapropertycommontothese．Especiallyforenteropathogenicbacteria，itappearedmoreimportant．Yersiniaenterocoliticawasafacultativeintracellularpathogen．TheallgeneofpathogenicY．enteroc