黑曲霉植酸酶高产菌株的选育及PhyA基因的克隆与序列分析

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1、黑龙江八一农垦大学硕士学位论文黑曲霉植酸酶高产菌株的选育及PhyA基因的克隆与序列分析姓名：石星明申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：朴范泽20050401摘要本研究对实验室保存和购买的9株黑曲霉菌株进行了产植酸酶酶活测定，并对产酶培养基和培养时间等条件进行优化，结果表明在麦麸半合成培养基中30℃发酵培养96h，产植酸酶活性最高，筛选出一株产植酸酶较高的3928菌株．酶活可达693咤／(昌min)：该菌株产生的粗酶液经60℃高温处理后，酶活保存率大于85％，适用于作饲料添加剂。该菌株经紫

2、外线诱变处理，可得到一株产植酸酶较高的2号菌株，酶活达到2050¨g，(g-mi】1)。为了获得高产菌株的phyA基因，以便比较其序列与网上报道标准菌株序列的同源性，为后期的表达提供材料，我们采用文献报道的中性裂解法提Aspe嘻Ilusniger3928的基因组DNA，并根据Genballl(中报道的黑曲霉基因序列，应用DNAsls和DNAsTAR设计、筛选出一对引物，并分别加入了EcoRI和NotI的内切酶位点。经PcR扩增后，得到一条长度约为1500bp的DNA片段，与试验设计相符。同时对P

3、CR反应条件进行优化，确定最佳反应条件。对PCR产物采用胶回收试剂盒进行回收，根据已报道的黑曲霉植酸酶曲yA基因的酶切图谱，对目的片段进行酶切，该基因能被SacI、PstI和SaII三种内切酶酶切，酶切片段大小与报道的相一致，鉴定了PcR扩增片段的正确性。该基因产物定向克隆到PM阻18T载体的多克隆位点上，构建了含有目的片段的重组质粒，并转化大肠杆菌JMl09，获得两株阳性克隆菌株，分别称之为1#和2桴。阳性菌株的序列测定表明，扩增片段中含有完整的真菌植酸酶phyA基因，扩增片段的长度为1506

4、bp，其中在+45bp～+146bp的102个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，基因内含有真菌内含子的特征保守序列，并且转录起始密码子均为A11G。该基因编码467个氨基酸，分子量大约是51．37kDa，包含有13个潜在的糖基化位点．N一端的19个氨基酸为信号肽序列，其余的448个氨基酸为成熟植酸酶的氨基酸序列。从氨基酸序列上还找到了植酸酶的活性位点序列：CRvTFAPvLsRHGARYPTDsKGK，它位于氨基酸序列的+7lbp～+93bp。其中RHGARYPT是微生物来源的植酸酶活性位点中

5、最保守的序列。序列比较结果显示：本研究克隆的phyA基因与AY513749和AF21s813的p崎A基因的同源性分别是98．87％和92．62％，编码的氮基酸序列同源性分别为97．43％和92．93％。关键词：黑曲霉，酶活，筛选，phyA基因，PcR，序列分析IIAbstractNines仃a．msA．Nigerswhichwerepreservedinlaballdpurchasedweredetem“11atedph”aseacbvi母，andselectthemedium柚d也etimeo

6、fcul6Vation．1飞eresultsshowed：pfD忆seac6Vi船isbest“ghest油wheatbraIlmediumandcultivate96h．wescreenedoutaMghproductioonstrain-3928，phytaseac蛀V畸couldgetto693鸺，(g‘min)．Phytasewas订ea把dbyhightempranlfeof60℃，preserv撕oncoefncientofphytaseactiV时exceed85％．Thes廿面n

7、waSmu诅genesis订℃atedby“travioletradia廿on’and雪0tahigherpmducnonstf伍n-2，phytaseactivitycouldgetto2050蚓(g·min)．Ne恤IspIit曲gwereusedf打e)【Il∞矗nggenomicDNAofAspe喀i11us．niger3928．About1．5kbspecific疗agmemw船obtained丘omgenomicDNAofAsper酉1lusniger3928byPcRampl∞ca

8、tionWmp血nerswhichhaveposjtioneIl巧meofEcoRI锄dNotIdesignedaccordingtothe1(Ilo、vIlsequencesofmephytaSegeneiIlt11eGeneBankbyDNAsIsandDNAsTA凡weseIectmebestconditiOnofreac廿on．PCRpmductuionw韪puriedandrecoveredbyPCRFragrnentRecOveryKit．Accordingt0n忙cIIzyme-c