离子束注入黑曲霉选育单宁酶高产菌株及其发酵工艺研究

《离子束注入黑曲霉选育单宁酶高产菌株及其发酵工艺研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、离子束注入黑曲霉选育单宁酶高产菌株及其发酵工艺研究刘会郑之明贡国鸿聂光军中国科学院离子束生物工程学重点实俭室摘要：为获得单宁酶高产菌株，利用低能盯注入技术对黑曲霉原始菌株TA9701进行诱变选育。在最佳辐照能量与剂量条件下，经过多轮注入，最终筛选到一株高产菌株J—T18。通过对底物浓度，接种量，通气量及发酵温度等发酵条件进行优化，突变株的单宁酶产量达到了38．5U／mL，较原始菌株提高了近四倍，且遗传性能稳定。同时研究了金属离子和表面活性剂对突变株产酶的影响，结果表明Mn2+与Sn2+对菌株产酶有促进作用。关键词；离子注入单宁酶黑曲霉选育发酵优化低能离子注入的生物学效应发现于上世

2、纪八十年代中期，作为一门新兴的边缘学科，目前已在植物、微生物诱变育种“’2’及植物基因转移D1等方面取得广泛应用。离子注入生物体集能量沉积、动量传递、质量沉积及电荷交换等效应“^61，同时还具有高的LET(传能线密度)值、集束性好、射程可控、能量沉积和质量沉积区域可控等特点订一’91，可以在损伤较轻的情况下，获得更高的突变率和更宽的突变谱。近年来，将离子束用于工业微生物的诱变育种工作，已经取得了可喜的成果。单宁酶(EC．3．1．1．20)是一种以单宁酸作为诱导物的诱导酶，广泛存在于各种微生物中。它可以水解单宁或没食子酸酯中的酯键与缩酚酸键，生成没食子酸及其他化合物‘1¨。单宁酶在

3、很多行业都有很重要的用途，主要用于饮料、精细化工、皮革、饲料、化妆品n0’儿1等方面。另外，在医药工业，特别是在生产没食子酸衍生物甲氧苄氨嘧啶中也具有很重要的用途。1．材料与方法1．1菌种黑曲霉(AspergillusnigerTA9701)，本研究室保存。1．2培养基菌种保存培养基：PDA培养基平板培养基(gL。1)：察氏培养基改良而得。琼脂15．0，NaN033．0，KH2P041．0，MgS040．3，FeS04·7H20，微量。单宁酸过滤除菌后加入，终浓度为2％(w／v)摇瓶发酵培养基(gL。)：籼米粉50．0，(NH4)2S0410．0，MgS040．3，KH2P043

4、．0，CaC035．0。单宁酸过滤除菌后加入，终浓度为2％(w／v)[12】．S2．1．3培养工艺将孢子接种于PDA斜面上，30oC培养3-4天。取10mL无菌水将斜面上的黑曲霉孢子彻底洗脱，并充分混匀使之成孢子悬液。取2mL孢子悬液(约107孢子)接于含50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，于30oC，180转／分培养80h。1．4离子注入诱变选育方法离子注入机：由中科院离子束生物工程重点实验室自行研制[13】。诱变处理：用10ml的无菌水将斜面上的孢子洗下，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀以便分开所有的孢子。取0．1ml的孢子悬液均匀涂布于平皿内，无菌风吹干后于注入机靶室

5、内进行脉冲式矿注入【14】。将处理后的样品每个平皿加入lml的无菌水洗下孢子，稀释并涂入已经准备好的平板培养基中，每个平板中加入0．1ml孢子悬液，用玻璃涂棒涂匀。接种后的所有平板于30℃倒置培养3．4天。挑选单菌落转接斜面培养，然后接入摇瓶培养基，筛选高产菌株。1．5分析方法存活率的计算：在每一个注入剂量下同时设置真空对照，对照样品同时放入靶室但不接受离子注入，其余操作与注入平皿相同。培养3天后对单菌落进行计数并计算出注入板上的菌落数和真空对照板上的菌落数之比，即为存活率。菌株突变率的计算方法是：分别在每个注入剂量下随机挑选20株单菌落，接摇瓶发酵3天后，测酶活，以高出原始菌株

6、酶活的5％以上者为正突变菌株，以低出原始菌株酶活的5％以上者为负突变菌株，计算两种突变类型在所挑选的20株注入菌中所占的比例分别作为正突变率和负突变率。酶活测定方法：发酵液用滤纸过滤，所得滤液即为粗酶液。酶活测定参照Iibuchi[15]的方法。将单宁酸溶解于O．05M、pH5．6的柠檬酸缓冲液中，配置成浓度为0．35％的样品，取样品4份，加入1份酶液，30℃反应一定时间，沸水浴灭活。取反应液0．1份加入10份95％乙醇，310nm比色。根据以下公式计算单宁酶的活性：U=114xOD3lo／t其中：OD3lo为310nm处的光密度，t为反应时间。一个酶活力单位的定义为：一分钟内能

7、降解lJ-tmol的单宁酸中酯键的酶量。2．结果与讨论2．1注入离子能量与剂量的选择离子注入后菌株的存活率，突变率与筛选效率跟离子的能量跟剂量有很大关系。现代育种理论证明，诱变的微生物致死率在70．80％左右时，正突变率往往很高[16】。也就是说当存活率在20％．30％范围时，能得到较高正突变率的菌株。100邑oho’薹，oo童皂詈S3∞05101520筠30EnergyofN+Implantation(key)Fig．1Influenceofenergyonsurvivalra