多杀菌素高产菌株选育及发酵工艺优化

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2、向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要多杀菌素是一种由刺糖多孢菌（S.spinosa）发酵产生的大环内酯类抗生素，是一种绿色广谱杀虫剂，兼具生物农药的安全性和化学农药的高效性。本论文以提高发酵法生产多杀菌素的产量为目标，对多杀菌素发酵的菌种改造、培养基成分和培养条件优化等进行了深入的研究，大幅度提高了多杀菌素的产量，为多杀菌素的工业化奠定了良好的基础。本研究获得的结果如下：根据多杀菌素的生物合成途径，对多杀菌素野生型产生菌ATCC49460依次

3、经过UV、亚硝酸钠诱变筛选甘氨酸和菜籽油双抗突变株4/26，产量达到了331.7mg/L，为出发菌株ATCC49460产量的4倍。对多杀菌素的摇瓶发酵工艺进行了优化，得到最佳的种子培养时间、接种量、发酵培养基的初始、装液量等。实验发现甲基化试剂如盐酸甜菜碱、氯化胆碱和卵磷脂不同程度地促进多杀菌素的合成，其中0.02%的氯化胆碱的促进作用最显著，将多杀菌素的产量提高24.26%。2+2+研究了金属离子Co、Cu、短链醇对多杀菌素发酵的影响，在0h、72h分别添加0.06g/LCoCl2•6H2O和0.04g/LCuCl2•2H2O使多杀菌素的产量分别提高

4、9.6%、13.6%。研究了不同氨基酸对多杀菌素合成的影响，发现甘氨酸和丙氨酸对产物合成的促进作用稍微高于于支链氨基酸，提高幅度均在20%左右。研究还发现，短链醇中异丁醇对多杀菌素合成的促进作用大于其他醇，并确定最佳添加时间为48h，浓度为90mM。研究补料分批发酵对多杀菌素的影响，发现发酵中期（96h）添加3%的混合油脂和1%的玉米浆，同时在144h补加1%玉米浆，pH在较小的范围内波动，大大促进菌体的生长和产物的合成，使S.spinosaLU104的产量为804.59mg/L是分批发酵的2.11倍。本文进行5L发酵罐小试，得到了5L发酵罐中补料分批

5、发酵过程的菌浓、pH值、溶氧和多杀菌素等参数随时间变化曲线，总结一些刺糖多孢菌的生长和代谢特性。在发酵罐中，多杀菌素的发酵单位最高达到327.78mg/L。最后建立了刺糖多孢菌LU104补料分批发酵培养的菌体生物量、多杀菌素浓2度和底物消耗的动力学，方程的拟合值与实验值吻合很好，其相关系数(R)分别为：0.9965、0.9834和0.9953，该结果表明，所选的动力学模型可以很好的描述多杀菌素发酵过程行为，为放大性实验研究提供基础。关键词：多杀菌素；刺糖多孢菌；混合油脂；菌种选育；发酵优化；动力学ABSTRACTSpinosadisanewclasso

6、fmacrolidecompoundsproducedbyaerobicfermentationoftheGram-positivebacteriaSaccharopolysporaspinosa.Spinosadisanewclassofhighlyeffectivebiologicalinsecticidewithlowtoxicity.Theaimofthisworkistoincreasetheproductivityofspinosadfermentation.AfterU.V.andNaNO2mutationwithrationalscre

7、ening,mediumcompositionandcultureconditionoptimization,thespinosadproductivityisincreasedgreatly.Thisworkprovidesreferencefortheindustrializationofspinosadfermentation.Accordingtothebiosynthesispathofspinosad,ahighyieldstrainS.spinosa4/26wasobtainedbyrationalbreedingoftheorigina

8、lwildstrainATCC49460withtheU.V.andNaNO2mutation