ε-聚赖氨酸高产菌株选育与发酵过程优化

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1、江南大学硕士学位论文ε-聚赖氨酸高产菌株选育与发酵过程优化姓名：陈旭升申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：毛忠贵20080801摘要本论文主要内容是，首先鉴定本实验室自行筛选的一株白色链霉菌Z_18是否具有合成￡_聚赖氨酸的能力；在此基础之上，建立了一种用于菌种改造中高产菌株筛选的方法；最后，对白色链霉菌Z_18发酵生产￡-聚赖氨酸的发酵工艺进行了初步研究。为了确定本实验室筛选的白色链霉菌Z-18具有合成￡一聚赖氨酸的能力，本论文利用高效液相色谱(HPLC)、液相一质谱联用(LC-MS)、核磁共振(NMR)、高效液相排阻色谱(GPC)等分析仪器对白色链

2、霉菌Z-18发酵生产的￡_聚赖氨酸产物进行了结构表征的研究。研究发现：白色链霉菌发酵生产的聚赖氨酸是由赖氨酸单体通过￡一NH2和a--COOH形成￡一酰氨键聚合而成，平均分子量为4210Da，并且对敏感菌——枯草芽孢杆菌生长有强烈的抑制作用。菌种改造对于提高菌株个体合成产物的能力是一种十分有效的方法。由于白色链霉菌的代谢途径还不清楚，所以现阶段选择传统诱变是提高其合成￡一聚赖氨酸能力的有效途径。本论文利用亚硝基胍(NTG)对白色链霉菌孢子进行诱变，用￡-PL+Gly作为抗性平板，用于高产菌株的筛选。通过建立这种新型诱变筛选方法，获得了一株产量为1．05g／L

3、，遗传稳定的突变株StreptomycesalbulusA—l，该突变株较出发菌株产量提高了54％。最后，本论文通过对发酵过程中溶解氧、转速、通风量和pH值等参数的单因素考察，确定了pH值是影响白色链霉菌Z-18合成￡一聚赖氨酸的关键性因素。研究发现，白色链霉菌Z_18在pH4．0以上有利于菌体的生长，但对产物的积累不利(O．8∥L左右)；而当pH维持在4．0左右时，不仅有利于菌体的生长，而且对产物的积累也起到积极的作用(1．6g／L以上)。随后，在控制pH4．0的情况下，采用补料分批培养方式，使得发酵时间延长至98h，并且使得菌体干重达到20eCt,左右，

4、与此同时，￡_聚赖氨酸产量也有了大幅度的提高，最高产量达到8．02eCt,，比摇瓶产量提高近10倍，比分批发酵提高了近5倍。可见，在白色链霉菌合成￡一聚赖氨酸的发酵过程中，控制pH4．0，再流加碳源和氮源可以使得￡一聚赖氨酸获得大量的积累。关键词：￡-聚赖氨酸，结构鉴定，诱变，抗性筛选，补料分批培养AbSn．aCtAbstractTheaimofourresearchwasmainlyfocusedonidentiflyingthestrainwhichwasscreenedfromsoilbyourselveshastheabilityofsyntheti

5、ce-polylysine，andthenweestablishmentamethodforsreeninghigh—yieldstrainsaftermutation．Finally,weconductedapreliminarystudyontheprocessofStreptomycesalbulusZ一18fermentation．Inthispaper,LC-MS，NMRandGelPermeationChromatography(GPC)wereusedforstudyingthestructureofthee-polylyineobtained

6、byfermentation．Theexperimentalresultsshowedthatthe￡-polylyine，withtheaveragemolecularweightofabout4210，ispolymerizedbymono—lysineswiththeaidofamidelinkagesbetweens-aminoanda—carboxylgroups．Theanti—bacteriaactivityexperimentshowedthatthee-polylysinehasverystronginhibitoryeffectonBac

7、illussubtilis．Strainoperationisaveryeffectivemethodforimprovingthestrainproduction．AstheStreptomycesalbulusZ-18metabolicpathwayisalsounclear，SOtraditionalmutationistheonlywaytoimproveitscapacityofproducinge-polylysine．1f11ispaperusedNTGeffectonspores，with￡一PL+Glyresistanceasascreen

8、ingplate．Throughtheestabli