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1、基于代谢途径研究多杀菌素高产菌株选育摘要：通过对刺糖多葩菌(Saccharopolysporaspinosa)多杀菌素代谢合成途径的分析，提出了一种代谢控制育种策略和提高诱变筛选效率的方法。以刺糖多鞄菌QYLZ88912菌株为出发菌株，选择不同照射时间分别对其进行紫外线照射处理，然后用含有不同抗性物质的摇瓶对诱变菌进行初筛，最终筛选出了1株高产多杀菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088o该菌株同时具有磺胺肌、链霉素和红霉素抗性，摇瓶发酵试验表明，发酵7d多杀菌素浓度可以达到1132.60mg/L,较出发菌株提髙了85.4%,经传代试验证明此菌株高产遗传特性稳定。关键词：代谢途径；代谢控
2、制育种；多杀菌素；菌落形中图分类号：Q819；Q815文献标识码：A文章编号:0439-8114(2013)10-2309-06当前中国农药的应用可以简单地总结为农药品种多、质量低、用量大、效率低、农产品中残留量高，对环境污染严重[1],因此开发高效绿色的新型农药显得尤为重要。多杀菌素(Spinosad)又称刺糖菌素，是由刺糖多砲菌(Saccharopolysporaspinosa)通过有氧发酵聚酮合成途径合成的大环内酯类抗生素，兼有化学农药的速效性和生物农药的安全性，不会对环境产生污染，对鱼、畜、禽安全系数高。多杀菌素作为一种绿色生物农药，其具有杀虫谱广、作用方式独特、杀虫活性高、半衰期
3、短、残留低、无抗药性、对人畜无害、环境污染少等优点[2],是一种具有触杀及胃毒毒性的新型微生物源杀虫剂，于1999年获得美国“总统绿色化学品挑战奖”[3],在农牧业生产中具有广阔的应用前景，该类产品的开发也具有良好的经济效益和社会效益。刺糖多胞菌属于糖多胞菌属(Saccharopolyspora),是迄今发现的惟一可以通过好氧发酵产生多杀菌素的菌株。目前国外多杀菌素的研究领域已延伸到开发杀虫活性更高、生物安全性更好的衍生物上。国内对发酵生产多杀菌素的研究起步晩，最近几年也取得了很大的进展，但较国外研究水平还有很大的差距[4]。国内报道多杀菌素高产菌株较高生产水平为800〜1260mg/L[
4、5,6],而国外早在10多年前就实现了工业化生产。多杀菌素的制备方法主要为微生物液体发酵合成，生物合成多杀菌素具有突出的优点，工艺条件较易控制、产品质量稳定、提取较为方便，但微生物液态发酵生产多杀菌素产量很低，主要问题是缺乏高产菌株，以致影响了该物质的应用。因此筛选高产菌株，为中国农药领域开辟新型绿色产品，对农牧业生产具有重要的意义。试验运用理性筛选思路和高效诱变方法，筛得高产菌株，并对其进行生物化学和遗传学分析。1材料与方法1.1供试菌种刺糖多砲菌QYLZ88912菌株，由天津北洋百川生物技术有限公司保藏。1.2培养基保藏分离培养基：可溶性淀粉20g/L,葡萄糖5g/L,酵母提取物3g/
5、L,玉米浆10g/L,MgS04・7H202g/L,琼脂20g/L,pH6.5〜6.7,121°C高压蒸汽灭菌20mino种子培养基：可溶性淀粉20g/L,葡萄糖5g/L,酵母提取物3g/L,玉米浆10g/L,MgS04・7H202g/L,pH6.5〜6.7,121°C高压蒸汽灭菌20min。发酵培养基：葡萄糖40g/L,可溶性淀粉30g/L,玉米浸液15g/L,棉子浓缩粉20g/L,酵母粉20g/L,碳酸钙3g/L,pH7.0〜7.2,121°C高压蒸汽灭菌30min。1.3主要试剂试验所用主要试剂情况见表1。1.4菌株QYLZ88912对所用抗性物质的耐受上限试验将出发菌株的砲子悬浮液
6、涂布于含有不同抗性物质、不同设计水平的平板，每个处理做3个平行，在相对湿度70%〜80%、29°C的培养箱中培养7〜9d,观察抗性平板的菌株生长情况，确定出发菌株对所用抗性物质的致死（耐受）上限。1.5菌株的诱变处理1.5.1胞子悬浮液的制备选择生长良好的多杀菌素出发菌株QYLZ88912斜面菌种，用无菌生理盐水将其胞子洗下，转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中振荡30min,使鞄子充分分散，用脱脂棉过滤砲子悬浮液，并调节胞子悬浮液浓度为106〜107个/mL,备用。1.5.2致死率测定取处理好的胞子悬浮液于30W紫外灯下30cm处分别照射不同的时间进行诱变处理，将诱变后的胞子悬浮液梯度稀释涂于保
7、藏分离培养基平板，于29°C避光培养7〜9d,计算致死率。1.6分析方法1.6.1色谱分析高效液相色谱仪Agilenttechnologies1200series；色谱柱AgilentNucleosil100-5C18,5um,150mmX4.6mm；流动相甲醇-乙睛-2%乙酸铁水溶液，甲醇：乙睛:2%乙酸鞍水溶液（体积比）为45：45：10；流速1.5mL/min；进样量10nL；检测波长250nm；柱温35°C；检测
