植酸酶高产菌株的筛选与酶的分离纯化

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1、植酸酶高产菌株的筛选与酶的分离纯化一、研究意义植酸酶是催化植酸及植酸盐水解为肌醇与磷酸（磷酸盐）的一类酶的总称。植酸及其盐类普遍存在于植物体中，是植物种子及营养器官中磷的主要贮存方式，一般植酸磷占禾谷种子及油料作物总磷60%~80%。在人和单胃动物食物中，植酸具有强烈的抗营养作用。这是由于一方面人和单胃动物缺乏分解植酸的酶类，无法利用植酸中的磷，另一方面植酸能与矿质元素如铁锌、钙和镁等蛋白质形成不溶性的稳定的复合物，降低了矿质元素和蛋白质的利用率。植酸酶作为一种新型的饲料添加剂，能分解饲料中的植酸，形成禽畜可利用的磷酸，提高饲料中有机

2、磷的利用率，减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。二、实验目的从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株，利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。三、实验材料3.1材料3.1.1（1）筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05%MgSO4.7H2O

3、，0.003%FeSO4·7H2O，1.5%琼脂，pH5.5。（2）液体发酵培养基：1.5%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO4·4H2O，0.003%FeSO4.7H2O，pH5.5。（3）查氏合成培养基：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂15~20g，水1000mL，pH自然， 121℃灭菌20min。 （4）斜面培养基：0.05%MgS04·7H2O，0.003%MnSO4·7H2

4、O，0.003%FeSO4·7H20，麸皮汁100ml，1.5~2%琼脂，pH5.5。3.1.2土样来源土样采自校园共青团花园或农田。去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm~10cm的土壤。3.2仪器水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、干燥箱、超净工作台、移液管等四、实验方法4.1流程土壤样品稀释液  测量各透明圈与菌落直径的大小初筛保藏菌种菌种鉴定复筛测酶活保藏菌种斜面培养基活化（三天）紫外诱变斜面制备单孢子菌悬液平板初筛正交实验摇床复筛测酶活测酶活分离纯化4.2方法4.2.1

5、菌株的筛选：土壤样品稀释1×105倍，涂布于筛选培养基上，30℃培养72h，挑取产生透明圈的菌株。对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在220r/min的转速下发酵培养，测其酶活。4.2.2酶活的测定：参照张若寒的钒钼酸铵法略加改进后进行测定。取1ml粗酶液加入2ml植酸钠溶液并摇匀（对照加入2ml钒钼终止液），37℃保温反应30min，立即加入2ml钒钼终止液（对照加入2ml植酸钠溶液），415nm测OD值，参照磷标准曲线计算酶活。酶活定义：按上述方法，在pH5.5的条件下，每分钟从0.0051mol的植酸钠溶液中释放1umol无机磷所需

6、的酶量为一个活力单位（U）。4.2.2.1磷标准曲线制备原理：利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼一钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量。表1标准曲线的各反应体系试管号123456标准磷溶液(ml)00.40.81.21.62无机磷浓度(mmol/mL)0246810去离子水(ml)21.61.20.80.40钒钼终止液222222OD值按表1加入试剂后，在415nm波长下测OD值，并绘制标准曲线。4.2.3菌种鉴定：将复筛酶活力最高的菌接种于

7、查氏合成培养基上，28℃恒温培养箱培养3d后，观察菌落形态变化。4.2.4诱变处理：取复筛酶活力最高的菌接的孢子悬液10ml加入直径为9cm的无菌培养皿中，在15W紫外灯下，距离28cm，进行诱变处理，时间依次为0、3、6、9、12、15min。经紫外线诱变后得到的突变株，将其中透明圈与菌落直径比值较大的进行复筛，测定突变株的酶活。4.2.5植酸酶的分离纯化：①取发酵后的培养液在4℃，4000r/min离心20min，取上清液，分别加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度分别为20%~90%，对植酸酶进行沉淀。沉淀重新溶解在乙酸缓冲液中，对蒸馏

8、水透析脱盐。②透析后的植酸酶溶液用DEAE-纤维素阴离子交换层析柱进行分离纯化，用NaCl溶液进行线性梯度洗脱，于280nm检测蛋白质，分部收集，测定每管酶活力。③将上述洗脱液用SephadexG-100凝胶柱进一步分离