产甲壳素酶菌株hd001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究

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1、中国海洋大学硕士学位论文产甲壳素酶菌株HD001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究姓名：于潇淳申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：韩宝芹20080601产甲壳素酶菌株HD001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究产甲壳素酶菌株HD001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究摘要甲壳素是由N．乙酰．2．氨基．2。脱氧．D．葡萄糖以p．1，4糖苷键连接而成的多糖，是多数真菌细胞壁、无脊椎动物、甲壳类动物外骨骼以及昆虫体表和昆虫中肠围食膜的主要结构成分，是自然界多糖生物合成量仅次于纤维素

2、的第二大天然资源，其降解产物具有多种用途。甲壳素酶能够催化水解N．乙酰．D．葡萄糖胺糖苷键，降解甲壳素得到几丁寡糖或N．乙酰氨基葡萄糖。甲壳素酶广泛存在于植物、动物及微生物细胞和组织中，从微生物中筛选产甲壳素酶菌株，并进行酶的研究，不仅具有一定的学术价值，而且对于自然资源利用、生物防治、环境保护、食品、医药等领域的发展都具有重要的实际意义。本研究以筛选高产甲壳素酶菌株为目的，从海洋泥样中分离、筛选出一株产甲壳素酶的菌株，命名为HD001，该菌在以胶体甲壳素为唯一碳源的平板上能产生较高活性的甲壳素酶

3、。通过对菌株HD001的发酵条件研究，确定了其产甲壳素酶最适培养基组分为(w／v)：(NI-h)2S042．O％、NaCIO．5％、K2HP040．07％、KH2P040．03％、MgS04·7H200．05％、葡萄糖O．1％、酵母粉0．3％、胶体甲壳素1．5％；最适产酶培养条件为：培养基起始pH值6．0，接种量1．0％(v／v)，以500mL三角瓶装瓶量为150mL，培养温度30"C，160r／min摇瓶培养120h，发酵液酶活力可达1．7U／mL。在优化条件下发酵培养菌株HD001，发酵液冷冻

4、离心，上清液采用30％～90％硫酸铵分级盐析、透析、冷冻干燥后制得甲壳素酶粗酶，粗酶经DEAE．纤维素离子交换层析、SephacrylS．100凝胶过滤层析分离纯化，制得电泳纯的甲壳素酶，酶纯化倍数为1】．98，收率为28．1％。SDS．PAGE电泳显示单一条带，其相对分子质量约为85．7kDa。对甲壳素酶进行酶学性质的研究，结果表明该甲壳素酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为5．6：酶活力在pH5．5～7．0时相对稳定；25℃放置24h酶产甲壳素酶菌株HDooI的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶

5、学性质研究活力基本不变。M92+对酶的活性有促进作用，Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Mn2+等离子对酶活力均有不同程度的抑制，以Mn2+最为明显。该酶的米氏常数‰为1．931mg／mL，最大反应速率ym就为2．381／,tmol／min·mL。关键词：甲壳素酶；发酵条件；分离纯化；性质产甲壳素酶菌株HD001的筛选、发酵及酶的分离纯化与酶学性质研究Studyonisolationandfermentationconditionsofachitinase—producingstrainHD

6、001，PurificationandcharacerizationofthechitinaseAbstractChitin,ap-l，4-linkedbiopolymerofN—acetylucosamine，isthesecondmainnaturalresourcesandthecomponentoffungalcellwallsandperitrophicmembraneofinsects．Decompositionproductofchitinhasvariousapplication．

7、ChitinaseCancatalysethereactionofhydrolyzingchitinintoN-acetylglucosamine(GlcNac)and(GIcNac)n．Chitinasewidelyexistsinanimals，plantsandfungi．Therefore，chitinaseisimportantinawidevarietyofbiologicalandbiotechnologicalprocesses，agriculturalandindustrialp

8、roduction,naturalresourcesutilization,biologicalcontrol，environmentalprotection,foodandmedicalexploitation．Studyonchitinasefrommicrobeisimportantinfindingnewsourcesofchitinase．Withthepurposesofscreeningandselectingalleffectivelychitinase·produ