产硫酸软骨素酶菌株筛选、发酵、酶分离纯化及性质是研究

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1、产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化及性质的研究产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化及性质的研究摘要硫酸软骨素酶在研究硫酸软骨素类糖胺多糖的结构、性质与功能等方面有多种重要用途。近年来，该酶在临床领域的应用广泛，用来治疗某些疾病如大骨节病、椎间盘突出等。同时，该酶在制备低分子量硫酸软骨素方面也存在着广阔的应用前景。因此，获得酶活力高的硫酸软骨素酶具有重要的理论和现实意义。本研究从微生物中筛选出一株高产硫酸软骨素酶的菌株，并对菌株的发酵培养条件、酶的分离纯化及酶学性质等做了系统的研究。通过初筛和复筛从

2、采集的样品中获得了一株高产硫酸软骨素酶菌株，编号为28，对其形态和生理生化特性进行了测定，初步鉴定该菌株为少动鞘氨醇单胞茵(Sphingomonaspaucimobilis)。该菌株所产的硫酸软骨素酶为胞外酶。为了提高产酶菌株的产酶能力，采用单次单因素实验方法对其进行了发酵产酶条件的优化。得到的最适发酵培养基组成为(％，w／v)：酵母粉1．O+硫酸软骨素0．5+NaClO．5+KH2P040．03+MgS04．7H2O0．5，起始pH8．5：最适发酵培养条件为：摇瓶培养1．0％接种量、250mL摇瓶装量40mL、2

3、5℃、100r／min振荡培养36h，酶活力可达1．2U／mL。硫酸软骨素酶的分离纯化，采用了(NH4)2S04沉淀、DEAE．SepharoseFastFlow阴离子交换层析及SephadexG一100凝胶过滤层析等纯化步骤，结果获得了电泳纯的硫酸软骨素酶，酶纯化倍数为155．62，酶收率为46．87％，比活力为98．04U／mg。经SDS—PAGE电泳呈单条带，分子量约为82．3kDa。酶学性质的研究包括pH、温度、金属离子、底物浓度和底物专一性等。结果显示：该酶为诱导酶，在不添加硫酸软骨素的培养基中没有酶活性

4、；该酶的最适反应pH值为6．5，最适反应温度为40'C；在实验所涉及的金属离子中，大部分金属离子对酶反应无影响；该酶对底物具有相对专一性，能降解硫酸软骨素、透明质酸和肝素等这一类结构相似的硫酸软骨素类糖胺聚糖，而对甲壳素和壳聚糖无降解作用。对该硫酸软骨素酶的酶解产物进行了质谱分析，结果显示该酶的降解产物几产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化及性质的研究乎全为二糖，纯度较高，测得的降解产物的分子量约为458Da。关键词：硫酸软骨素酶；发酵条件优化；分离纯化；酶学性质lI产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离

5、纯化及性质的研究StudyontheScreening，FermentationofChSase—ProducingStrains，andPurificationandPropertiesoftheChSaseAbstractChondroitinasehasavarietyofapplicationsinmanyways，suchasstudyingtheglycosaminoglycans’structure，propertiesandfunctionsandSOon．Recentyearstheapplica

6、tionofChSaseintheclinicalfieldisextensive，curingsomediseasessuchastheKeshinBeckdisease，intervertebraldiscprotrasionandSOon．Atthesametime，italsohasabroaduseinpreparinglowmolecularweightchondroitinsulfate．Soitisofimportanttheoreticalandpracticalsignificanceforge

7、ttingChSasewithhighenzymeactivity．ThisstudyscreenedaChSase—producingstrainwithhighactivity，andresearchedthefermentation，purification，andpropertiesoftheChSasesystematically．ThestrainwithhighChSaseactivity,numbered28，wasobtainedfromthesoilspecimenbymethodsofprel

8、iminaryandsecondscreening．ItwasidentifiedtobeSphingomonaspaucimobilisaccordingtobiologicalcharacteristicsandbiochemicalreactiontests．TheChSaseproducedbythestrainwasextracellular—en