产硫酸软骨素酶菌株筛选、发酵条件优化及酶解产物分析

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1、谨以此论文献给敬爱的韩宝芹老师和刘万顺老师以及关心和帮助过我的亲人和好友-------于淼产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶解产物分析学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意

2、。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNK

3、I《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶解产物分析摘要硫酸软骨素酶（chondroitinase,ChSase),是一类主要存在于微生物体内，能将多种酸性粘多糖如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、透明质酸等降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该酶在研究机体内硫酸软骨素糖胺多糖的功能、结构与分布方面、在治疗动脉粥样硬化、关节炎等方面有着广泛的应用前景，同时，

4、也用于制备低分子量硫酸软骨素。低分子量硫酸软骨素对防治风湿性炎症和动脉粥样硬化方面相对于大分子量硫酸软骨素有更好的疗效。利用酶解法制备低分子量硫酸软骨素相对于目前广泛采用的物理降解法、化学降解法不需要较高的实验设备，也不会污染环境。因此，获得大量的酶活力高的ChSase具有重要的理论和现实意义,也是本实验的目的。因而本论文对产ChSase菌株的筛选、菌株产酶条件、菌株的鉴定、酶解产物等做了系统的研究。在本实验中，利用平板快速筛选和复筛从土壤中筛选出一株高产ChSase菌株，编号为12，通过对其形态和16SrRNA基因序列的比对，将该菌

5、株鉴定为节杆菌属菌株（Arthrobactersp.），产酶方式为分泌型表达。为了提高12号菌株的产酶水平，采用单次单因素实验方法对其碳源、氮源、无机盐及各发酵条件进行了研究，采用正交实验方法对碳源浓度、氮源浓度、无机盐浓度及pH进行了研究。得到的最佳培养基组分为（w/v）：硫酸软骨素0.8%、KH2PO40.02%、酵母浸粉0.6%、MgSO4·7H200.8%、初始pH6；最适发酵条件为：按1.5%（v/v）接种量将种子菌液接入50ml/250ml的三角瓶中于25℃，150r/min振荡通气培养72h。以上述条件发酵培养食砜节杆菌

6、时，酶活力可达3.981U/mL,为目前已报道的产酶活力较高的菌株。最后，本文初步分析了12号菌株产生的硫酸软骨素酶的酶解产物。质谱分析的结果显示，该酶降解硫酸软骨素的产物几乎全为单糖和二糖，有较高的纯度，测得的降解产物中二糖的相对分子质量约为458Da，单糖的相对分子质量为228Da。关键词：硫酸软骨素酶，食砜节杆菌，发酵条件优化，酶解产物IThescreeningofchondroitinaseproducingstrain,optimizationoffermentationconditionsandanalysisofhydr

7、olysateseAbstractChondroitinase(ChSase)isalyase,whichexistsinmicroorganisms,anddegradesavarietyofacidicmucopolysaccharidessuchassulfuricacid,dermatansulfate,chondroitinsulfateandhyaluronicacidtooligosaccharideandunsaturateddisaccharides.Theenzymehasabroadapplicationpros

8、pectsinmanyaspectssuchasresearchingthefunction,structureanddistributionofthevivochondroitinsulfateglycosaminog