淀粉酶高产菌株筛选及发酵条件优化研究 - 副本

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1、第29卷第10期河南科学Vol.29No.102011年10月HENANSCIENCEOct.2011文章编号：1004-3918（2011）10-1185-05淀粉酶高产菌株筛选及发酵条件优化研究1，21，21，211权淑静，马焕，解复红，谢宝恩，周伏忠（1．河南省科学院生物研究所有限责任公司，郑州450008；2．河南省微生物工程重点实验室，郑州450008）摘要：从济源市麦田的土壤中筛选工业生产上有潜在应用价值的高产淀粉酶菌株，通过平板初筛和摇瓶复筛，得到高产淀粉酶细菌菌株P11（2）.对其产酶条件进行优化，最终得到最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为酵母粉和蛋白胨组合，加入MgSO4可

2、以促进产酶，加入CaCl2或FeSO4抑制产酶.经正交试验确定培养基的最优组成，优化后的培养基组分为：可溶性淀粉20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠5g/L.该菌株在发酵4d时产酶能力最强；最适宜的发酵温度为于37℃；最佳发酵初始pH值为8．0.优化后的酶活是优化前的3倍，达到183．12U/mL.关键词：淀粉酶；筛选；优化中图分类号：TQ925+.1文献标识码：A淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，能够水解淀粉分子生成包括糊精在内的不同水解产物并逐步生[1-2][3-4]成由葡萄糖单位组成的聚合物.淀粉酶被广泛应用于淀粉液化糖化、

3、纺织、烘焙、酿造、饲料、造纸、化工[5]等工业过程中，甚至扩展到医药和化学分析领域，是商品化生产最早、应用最早、应用范围最广和用量最大[6][7]的工业酶类之一，占据了酶制剂市场份额的25％~33％左右.[8]淀粉酶虽然可以来自动物或植物，但目前工业生产上一般都以微生物发酵法大规模生产.虽然不少微生物能产生淀粉酶，但适合商业生产需要的菌株仍然很少，在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件.各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作，对高产淀粉酶菌株的选育已成为[9]生物工程的研究热点.本研究以在济源市麦田采集的土壤为原料，旨在分离出高产淀粉酶菌株作为出发菌株，研究其产酶条

4、件并对发酵培养基进行优化，进一步提高其产酶能力，为使其最终应用于工业生产、创造效益打下基础.1材料与方法1．1材料1．1．1土样来源济源市麦田土壤.1．1．2培养基平板初筛培养基：可溶性淀粉15g，KNO31g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0．5g，NaCl0．5g，FeSO·47H2O0．01g，H2O1000mL；pH7．2～7．4.斜面培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L；pH7．4.种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，H2O1000mL；pH7．4～7．6.基础发酵培养基：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，酵母粉

5、5g，K2HPO41g，NaCl1g，H2O1000mL；pH7．4.1．2试验方法1．2．1菌株筛选平板初筛：将1g从麦田中采集的土样加入内装100mL无菌水和12～13个已灭菌的玻璃珠的三角瓶中，振摇10min左右，充分打散土样，梯度稀释后取200μL样品，涂布于初筛平板上，30℃恒温培养24h.在平板上喷洒碘液，挑出水解圈直径（D）/菌落直径（d）比值大的菌落，进一步划线分离后，编号并斜面保存.复筛：将初筛获得的分离菌株接入种子培养基，在37℃环境下、180r/min培养15h，以2％接种量至种量至发酵培养基，相同条件下培养4d后测定酶活.收稿日期：2011-08-15基金项目：河南

6、省重大公益性科研项目（091100910500）作者简介：权淑静（1980－），女，河南洛阳人，助理研究员，硕士研究生，研究方向为生物技术.-1186-河南科学第29卷第10期1．2．2酶活测定方法发酵液5000r/min离心10min，取上清液即得粗酶液.采用DNS法测定还原糖的含量，方法是将底物（1％的淀粉溶液），即将1g淀粉溶于100mL的pH7．5，Tris－HCl缓冲液中加热使其溶解.对照组（180μL底物，加20μL缓冲液，混匀）、样品组（180μL底物，加20μL稀释酶液，混匀）.将样品组、对照组均放入50℃水浴锅中保温10min，取出后各加200μL的DNS，沸水浴5min

7、后取出，用蒸馏水定容至2．5mL，混匀后520nm紫外光下测OD值.酶活力单位（U）定义为：50℃，pH7．5条件下每分钟从可溶性淀粉中释放1μmoL葡萄糖所需的酶量.1．2．3最佳碳源的确定500mL三角瓶中各装50mL基础发酵培养基，其中的碳源分别为可溶性淀粉、玉米淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、麦芽糖、乳糖；设3个重复.接入种子液2mL，37℃，180r/min培养4d，测定粗酶液酶活.1．2．4最佳氮源的确定500mL