高产淀粉酶菌株的筛选

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1、高产淀粉酶菌株的筛选一：前言1.掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。2.巩固以前所学的微生物学实验技术。3.学会筛选高产淀粉酶菌株。关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。2.从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。a)采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做

2、各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。b)富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。c)初步筛选：i.初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。ii.初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养

3、。d)分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。e)性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl

4、、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉三：实验步骤1培养基的制备及其仪器的灭菌（1）按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl1.3g、淀粉2g、溶于50mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉放入烧杯中。加水到250mL熔解,并做好标记,再加入琼脂加热溶化,溶解2h，最后补充水到标记处，装入三角烧瓶内，加塞包扎。（2）试管中加入9ml水，2个

5、锥形瓶中加入150mL水，将所有待灭菌仪器和培养基用报纸包扎，121℃，30分钟高压蒸汽灭菌。（3）倒平板将灭菌的培养基冷至50℃左右，三角瓶中的培养基倒平板，并贴上标签，静置待用。2产淀粉酶菌株的分离、纯化（1）采集土壤样本取离地面5-15cm处的土样10g（2）稀释称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，至于摇床摇1小时，使土样和水充分混合，使细胞分散。用一只无菌吸管吸取1ml土壤悬浮液加入盛有9ml含有无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，依此稀释10-2、10-3、10-4、10

6、-5、10-6几种稀释度的土壤溶液。（3）初步筛选用稀释样品的不同吸管分别依次从10-6、10-5、10-4、10-3样品稀释液中，吸取0.2mL于冷却凝固的平板上，用涂布棒涂抹均匀。倒置于37℃温箱中培养24小时。培养24小时后，取出平板，注入1-2ml碘液，观察其透明圈，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有透明圈，说明该菌能产生淀粉酶使其水解。从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的单菌落，用接种环沾取少量菌株采用四区域划分法。（4）取长势好的菌株重复筛选3次（5）将筛选所得单菌落进行革兰氏染色观察其形态涂片、

7、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。镜检：油镜观察染色结果。（6）酶活力测定接种环沾取少许菌株于装有5ml无菌水的试管中，充分振摇，倒入离心试管中，4000r/min离心30min,取3支试管，标明BO,B及U（BO：空白管，B：对照管，U：待测管），分别加入0.4g/ml淀粉

8、缓冲液1ml，U管中加入离心所得的上清液100ul，BO管中加入蒸馏水100ul。混匀后放入37℃水浴箱准时水浴7.5min，取出加入碘应用液1ml摇匀，此时B管中加入上清液100ul。各管再加蒸馏水摇匀，660nm的波长下测吸光度。酶活力计算：U＝（AB-AU）×80ABO（1）移液管吸取0.2ml菌悬液于12个平板上，用涂布棒涂抹均匀，分别紫外光照突变3