溶菌酶高产菌株的筛选

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1、溶菌酶高产菌株筛选及其产酶研究1、溶菌酶的分布目前已知溶菌酶在自然界中分布极为广泛，已经发现高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中都有溶菌酶存在如鸡卵清中含有相当量的溶菌酶（约3.4％至3.5％），此外，人体、蜜蜂、蚜虫等均发现有溶菌酶动物溶菌酶植物溶菌酶微生物溶菌酶植物中的溶菌酶通常比动物来源的溶菌酶具有较大的分子量溶菌酶人们从上世纪６０年代发现微生物也产生溶菌酶，并且进展很快。溶菌酶可以用溶菌谱来作为酶专一性的主要指标，但由于这类酶的作用机制十分复杂，所以这种分类并不能反映酶的作用本质，现在以酶的作用性质来进行分类。一般把微生

2、物产生的溶菌酶分为７类①内．Ｎ．乙酰已糖胺酶②酰胺酶③内肽酶（Peptidasc）和蛋白酶④β-1，3.β-1，6葡聚糖酶和甘露糖酶（葡甘露糖酶）⑤磷酸甘露糖酶⑥壳多糖酶⑦脱乙酰壳多糖酶2、溶菌酶菌株的筛选由于溶菌酶微生物的分布广泛性，所以本课题从土壤微生物入手，从中筛选分离出溶菌酶高产菌株，并进行培养保存其中的土壤样品是来自17个省市地区的各种植被类型土壤样品156份主要培养基(l)指示菌培养基:蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl1%，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。(2)初筛培养基及菌株的保存培养基:蛋白胨1%，牛肉膏0

3、.5%，NaCl1%，琼脂1.5%-2%。pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。(3)基础培养基:蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl1%。pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。(4)摇瓶发酵产酶培养基:可溶性淀粉1.25%，牛肉膏2.5%，玉米浆1%，Tween0.1%，pH值调至7.0，121℃灭菌20min。产酶菌株的分离采用双层平板法以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用混菌方法制成下层培养基将土壤样品充分研磨，梯度稀释后，取1mL土壤悬液加入已经凝固的下层培养基上，再倒入50℃营养琼脂培养基，混匀，制成上层培养基28℃

4、培养，每天观察并记录下层：上层：又叫双层琼脂平板法先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。用灭菌牙签挑取在初筛双层平板上产生透明圈的菌落，进行划线分离挑取单一菌落，点接到含金黄色葡萄球菌的验证板上，37℃培养2d。观察其是否再次产生透明圈，以及产圈稳定性。将经过验证仍产透明圈的菌株进行纯化并保存。高抑菌活性菌株的初步筛选将分离得到的具有抑菌活性的菌株进行摇瓶发酵，利用营养肉汤培养基，300mL三角瓶装瓶量50mL，接种量2%，37℃，200rpm摇振培养。每8h

5、取发酵液，在含金黄色葡萄球菌的营养琼脂平板上用直径6mm无菌中空管打孔，注入50uL发酵液。37℃温育24h。观察结果并用游标卡尺测量透明圈直径。筛选抑菌圈较大的菌株。抑菌活性成分的初步鉴定将筛选到的具有较强抑菌活性菌株进行摇瓶发酵，取36h发酵液12000rpm、20min离心。取上清液进行蛋白酶K处理，20uL蛋白酶K(20mg/mL)加入500ul上清液中，50℃反应1h，各取50匹在含有金黄色葡萄球菌的营养琼脂板上打孔点样，37℃培养24h观察透明圈。将发酵液离心取上清进行透析浓缩，发酵液10mL加入透析袋(透过规格8一14.0KD)中

6、，扎紧，置于聚乙二醇20000中，4℃透析过夜。测定透析前后酶活力。溶菌酶高产菌株的复筛对初步鉴定抑菌活性成分是蛋白质的高活力菌株进行摇瓶发酵试验，测定溶菌酶活力，根据产酶活力，结合菌株特性，综合确定筛选菌株。