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1、Lipstatin高产菌株筛选【摘要】以毒三素链霉菌XC-lp-2的变株OT-3为出发菌株，经UV和微波复合诱变处理，并在含豆油的平板上定向筛选耐豆油突变株，获得了高产突变株XC-lp-69，其lipstatin发酵效价达到911μg/ml，较出发菌株OT-3提高了71.6%。传代试验表明突变株XC-lp-69的高产遗传特性稳定。【关键词】Lipstatin；菌种选育；诱变；毒三素链霉菌ABSTRACTAfterStretomycestoxytriciniOT-3icroutantsl,orethanthatofthestartingst
2、ainOT-3.ThesubcultureexperimentsindicatedthatthehereditarycharacterofhighproductivityofstrainXC-lp-69isstable.KEYgSO4·7H2O1.0，自来水配制，pH7.0～7.2。(3)发酵培养基(g/L)冷榨黄豆饼粉30.0，甘油20.0，大豆卵磷脂12.0，酵母粉10.0，豆油5.5，自来水配制，pH7.0～7.2。1.3培养条件(1)斜面培养条件培养温度(30±0.5)℃，相对湿度35%～50%，培养时间120～150h。(2)种
3、子培养条件培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间20～24h。(3)发酵培养条件培养温度27℃，250ml三角瓶装量25ml，转速240r/min，培养时间120h。1.4诱变处理(1)紫外线照射将单孢子悬浮液置紫外诱变箱(紫外灯功率30照射垂直距离30cm)中诱变处理一定时间，用黑布包好，在红灯下用无菌水做梯度稀释后涂布平板，30℃避光培养5～6d，挑单菌落传斜面。(2)微波处理将单孢子悬浮液置于灭菌10ml试管中，在500ml烧杯中冰浴；然后将冰浴烧杯连同试管放入800l，4000r/min离心1
4、5min，上清液用丙酮1∶4的比例稀释摇匀浸泡1h，取上清液再次10000r/min离心3min或膜过滤，取清液进行HPLC测定胞外效价，并用同样的方法测定菌丝体沉淀中的产物量(胞内效价)。本文中发酵效价为胞内外效价之和。HPLC色谱条件色谱柱C18ODS(4.6mm×250mm，5μm)，柱温35℃，检测器DAD(HP1100)，检测波长210nm，流动相为乙腈∶水(86∶14)，流速0.8ml/min。(2)pH测定用酸度计测定。(3)菌丝浓度测定取10ml发酵液，4000r/min离心15min，测定沉淀物在发酵液中所占比例作为菌丝
5、浓度。2结果与讨论2.1出发菌株的选择取4℃冰箱保存的10株菌(XC-lp-2经多次自然分离或其他诱变处理，经不同模型选择的较优菌株)，连续发酵三批，其结果平均值见表1。由表1可以看出OT-3菌株lipstatin发酵效价较高，因此选择OT-3为出发菌株。2.2紫外线诱变处理结果试验中对出发菌株OT-3进行不同剂量的UV诱变处理，经梯度稀释后涂布平板，待菌落生长成熟后，从每个处理剂量平板中挑取30个单菌落分别传斜面，逐一接种发酵瓶，考察诱变株的发酵水平，统计其致死率、变异率(±10%以上)和正变率，所得结果见表2。由表2可知，随紫外线照射
6、时间的延长，致死率、变异率相应增加，但正变率较高出现在偏低剂量(60s)，这与有关报道［4］一致，故后续试验中均采用UV照射60s。经多次UV诱变选得菌株OT-63，较出发菌株OT-3效价提高20%，达到636μg/ml。2.3微波诱变处理结果试验中对出发菌株进行了不同时间的微波照射处理，稀释涂平板，待菌落成熟后转接斜面，摇瓶发酵考察。统计致死率、正突变率和产量的最大提高率，结果见表3。由表3可以看出，随着微波照射时间的延长致死率上升，正变率下降，但产量最大提高率随时间延长而上升，故后续试验采取微波照射7min。以OT-63为出发菌株，进
7、行微波诱变，微波处理后的孢子悬浮液经适当稀释后涂布于分离平板，待菌落成熟后，挑单菌落传斜面，进行摇瓶发酵初筛和复筛。得到高产菌株,PaulB.Olistatat［J］.Drugs,1998,56(2):241［2］MeliaAT,ZhiJ,ZelaskoR,etal.Theinteractionoftheliposeinhibitororlistatacol,1998,54(9～10):773［3］HollanderPA,ElbEinSC,HirschIB,etal.Roleoforlistatinthetreatmentofobesep
8、atientssinthelipaseinhibitorlipstatin［J］.JBiolChem,2000,275(28):21192［6］MarkusG,,2001,66(13):466
