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1、聚卷基脂肪酸酯高产菌株筛选摘要：目的：探讨聚轻基脂肪酸酯产生菌的筛选方法。方法：从土壤中取样，经过尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛，筛选菌株。结果：成功地获得聚释基脂肪酸酯生产菌并将其命名为Rhizobiumsp.H2-5,其胞内产物产率为36.96%O结论：通过尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛进行聚軽基脂肪酸酯高产菌株筛选，方法准确、可靠，值得应用推广。关键词：聚释基脂肪酸酯；尼罗蓝；筛选1材料与方法1.1材料及试剂Ls-C50L立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备厂)；HZQ-Q全温振荡摇床(中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；Fr
2、iocell生化培养箱(BMHIndustrumentsCo.);AnkeTGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；S-3700N扫描电子显微镜(日本日立公司)；1%的尼罗蓝溶液；0.3%(w/v)的苏丹黑B染液、0.5%(w/v)的番红染液等。富集培养基(g/L)[lJ：醋酸钠10.0,酵母粉1.5,Na2HP04•12H203.8,KH2PO42.65,MgS04•7H200.2,CaC120.05,FeC130.01,ZnS040.01；筛选培养基：含琼脂2%,尼罗蓝浓度为50ug/mL的富集培养基。1.2方法1.2.1初
3、筛[2]取溶于水的土壤样品上层液1.OmL,接于10.OmL富集培养液中32"富集培养24h,反复传代培养至获得纯培养菌株。取富集培养液对灭菌后筛选培养基进行梯度稀释，然后涂布到初筛培养基上。初筛培养基321恒温条件下倒置培养48h,在波长365nm紫外灯下观察，标记并挑取发荧光的单菌落保存。1.2.2复筛纯培养菌株摇床培养48h后，离心分离弃上清液，挑取离心后得到的菌体涂片、干燥、固定，苏丹黑B染液染色15min,洗脱至无色，再用番红染液复染2min,水洗，镜检观察是否有蓝黑色的脂肪颗粒[3]。1.2.3PHA提取取复筛后的菌株摇床
4、培养，收集、离心发酵液，收集菌体并烘干至恒重，称量得干菌体重量(CDW/g)o加入氯仿超声提取，向提取液中加入50ml甲醇水溶液析出白色絮状固体PHA[4],抽滤分离出PHA,再次烘干至恒重，称量得PHA提取量。1.2.4鉴定制涂片进行革兰氏染色以及芽胞染色，显微镜下观察菌体大小、形态以及有无芽鞄生成。2结果2.1初筛菌落呈现黄绿色，黄色和橙色荧光色。根据荧光色的差异分得11株纯培养物，接种至斜面培养基上，『C低温保存。2.2复筛菌体外围泛红，菌体内部可见明显的蓝黑色颗粒的菌株可能是产生PHA的细菌。2.3胞内产物提取率根据PHA提取
5、率（％）=Wp：Wc=（PHA提取量/CDW）X100%[5]计算各产物的提取率。菌株H2-5的胞内产物产率最高，达到36.96%O其次为H2-2,提取率为27.32%,具体结果见表lo2.4鉴定结果菌株H2-5的菌落呈圆形，表面光滑，大小均一，边缘整齐，菌落潮湿呈淡黄色，半透明。革兰氏染色结果表明菌株H2-5为革兰氏阴性菌，菌体形状为杆状，无荚膜，不形成芽胞。3结束语聚務基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate,PHA）是可以由很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要作为细胞内碳源贮藏性物质而存在，因而具有广泛应用的
6、价值[6]。本研究采用尼罗蓝荧光初筛、苏丹黑染色复筛进行聚軽基脂肪酸酯高产菌株筛选，扩大了菌株资源，并获得一株新菌株，为进一步开发PHA的应用奠定基础。此外，我们还对菌株H2-5进行了生理生化实验、并绘制生长曲线。结果与文献[7]所述一致，均表明菌株H2-5不能水解利用淀粉作为碳源，也不能利用柠檬酸盐，且适应期短，生长快速，接种18h左右就可达到稳定状态。对提取菌株H2-5基因组DNA进行16SrDNA基因扩增测序，结果表明H2-5为根瘤菌属。参考文献[1]张圆，孙雪南，陈邦，等•利用微生物混合培养技术生产聚軽基烷酸(PHA)研究[J
7、].微生物学报,2003,43(006)：799-804.[2]YilmazM,SoranH,BeyatliY.Determinationofpoly-B-hydroxybutyrate(PHB)productionbysomeBacillusspp.WorldJournalofM-icrobiology&Biotechnology,2005,21：565~56.[3]GanduriV,GhoshS,PatnaikP.MixingcontrolasadevicetoincreasePHBproductioninbatchferment
8、ationswithcoculturesofLactobacillusdelbrueckiiandRaistoniaeutropha[J].ProcessBiochemistry,2005,40：257-264.[4]堵
