苦荞中芦丁降解酶的分离纯化与产酶菌株的筛选

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1、网川农业人学硕上学位论文中文摘要苦荞(FagopyrumtataricanGaerth)是唯一一种不属于禾本科的双予叶杂粮作物，其籽粒中不仅含有丰富的芦丁，而且还有少量的芦丁降解酶(rutindegradingenzymes，RDEs)。在一定条件下，芦丁可以降解成槲皮素、芸香糖等物质，由于槲皮素具有抗氧化、清除体内自由基、防癌抗癌等生理功能，其具有广阔的应用开发前景。目前，芦丁转化成槲皮素的方法主要是酸水解，但大量酸的使用容易造成环境污染，新兴的微生物发酵技术由于成本低廉、环境污染小等特点逐渐走上时代的舞台。．本论文首先探讨了芦

2、丁降解酶的提取、分离和纯化，以及酶学性质和反应的最适条件；然后从自然发霉的苦荞粉中筛选出一株产芦丁降解酶的高活性菌株，并对菌株进行形态和分予生物学鉴定；最后研究了活性菌株接种于苦荞粉发酵，以期提高槲皮素的得率，从而为微生物发酵辅助提取槲皮素探索出一条有效途径。本研究具体结果如下：1．从成熟的苦荞籽粒中提取出了芦丁降解酶粗酶液，证实了苦荞籽粒中芦丁降解酶得存在。并用葡聚糖凝胶柱SephadexG．100和阴离子交换柱DEAEcellulose．32分离纯化，在出峰时收集、浓缩各峰相对应的洗脱液，然后分别检测酶活性。用聚酰胺薄层层析(

3、polyamide．TLC)定性检测槲皮素的生成，根据槲皮素的斑点确定有各峰的活性，之后用HPLC测定活性峰的酶活。结果酶的比活性由粗酶液59．2U／rag提高到671．4U／rag，纯化倍数达到了11．3倍，回收率为3．5％。2．经过柱分离纯化后所得的酶液经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)检测，酶分子量大小为60kDa左右。3．紫外分光光度法对芦丁降解酶反应条件进行研究，结果最适温度为40"C，当温度高于60℃时酶才开始缓慢失活：最适pH值为5．0，酶活随pH变化而变化。4．从自然发霉的苦荞粉中驯化、分离菌株，用p

4、olyamide—TLC检测出3株菌株有产芦丁降解酶活性，分别编号为W2、Y2和B3。3株菌株经HPLC测定，表明B3菌株活性相对较高，单位活性达到3．42U／mL，总活性为171．0U。5．选取相对活性较高的B3菌株，从形态和分子生物学方面进行鉴定。其形态特征为：菌落呈青色，质地粉粒状。菌丝有横隔，分身孢了梗顶端不膨大，无顶囊，经多次分枝产生几轮对称或不对称的小梗，小梗顶端有成串的分身孢子。由分身孢-了梗、小梗、分身孢子等组成了分身孢子穗，分身孢予穗呈扫帚状。确定为青霉属Penicillium。进一步对B3菌株进行18srDNA

5、—ITS序列同源性进行分析，表明B3菌株与青霉菌四川农业人学硕。{：学位论文Penicillium(arinosum(基因库中编号：AF527057．1)在系统进化树上的位置最接近，同源性达到100％，B3菌株为Penicilliumfarinosum。6．B3菌液接种子苦荞粉中(料液比=l：2．5)30。C培养5d，80％L,醇提取，直接与苦荞粉相同条件发酵并在相同条件下提取，比较得出添加B3菌株的苦养粉培养基中槲皮素得率提高了5．1倍。关键词：苦荞麦芦丁芦丁降解酶槲皮素青霉菌株II网川I农业大学硕．{：学位论文Purifica

6、tionandcharacterizationofrutindegradingenzymesfromtartarybuckwheat，andscreeningofRDEs—producingstrainLuoQing—lin(Biochemistry&MolecularBiology)DirectedbyProf．ShaoJi—rongAbstractFagopyrumtatarican(L．)Gaerthbelongstodicotyledonousplantandalsoactsascerealcrop．Itnotonlyco

7、ntainsrichmtin，butalsoexistssomerutindegradingenzymesintartarybuckwheatseeds。Undercertaincondition，therutindegradingenzymescanhydrolyzerutintoproducequercetin，mtinose，eta1．Quercetinhasfewphysiologicalfunctionssuchasantioxidative，radicalscavengingactivityandanticancer,

8、consequently,ithashighmedicinalvalueandprovidesagoodperspectiveoncommercialmarket．Atpresent，thereisonlyonewaythatacidhydroly