谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究

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1、谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究摘　要　通过用乙酰胆碱酯酶抑制法检测有机磷农药，从土壤中分离筛选出能降解敌敌畏的7个菌株，从其中降解能力较强的菌株OPD7提取胞内酶，并进行酶学性质的研究。结果表明，该酶分解敌敌畏的最适pH为7.0，最适温度为42℃，pH稳定范围为6-8，在低于47℃时稳定；该酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、乐果和氧化乐果。关键词　敌敌畏　有机磷农药降解酶酶学性质　　谈产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究摘　要　通过用乙酰胆碱酯酶抑制法检测有机磷农药，从土壤中分离筛选

2、出能降解敌敌畏的7个菌株，从其中降解能力较强的菌株OPD7提取胞内酶，并进行酶学性质的研究。结果表明，该酶分解敌敌畏的最适pH为7.0，最适温度为42℃，pH稳定范围为6-8，在低于47℃时稳定；该酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、乐果和氧化乐果。关键词　敌敌畏　有机磷农药降解酶酶学性质有机磷农药(Organophosphates，简称OPS)具有杀虫效率高、防治范围广、成本低等特点，在保护农作物免受病虫草害侵染、提高粮食产量等方面发挥了巨大作用，大大促进了农业生产[1]，但同时它们也对人类赖以生存的环

3、境造成了严重的污染，而且经常导致蔬菜和水果等农产品农药残留超标，直接危害人们的身体健康[2]。因此，当前迫切需要建立一种用于治理环境污染、去除农产品的农药残留的有效方法。目前最有潜力的有效方法之一是生物技术的方法：利用能够降解农药的微生物来治理受农药污染的环境，利用农药降解酶来清除表面农药残留超标的农产品[3]，其前提是培育出能高效降解农药的菌株和制备出高效的农药降解酶。为了实现用生物学方法来解决农药残留危害的目标，建立一种快速、简便、成本低的筛选农药降解菌并从中提取降解酶的方法，是当前生物学家首先

4、要解决的重要任务。本文旨在探索一种分离筛选能高效降解有机磷农药的微生物的简单、快捷的方法，同时对有机磷降解酶进行初步研究，为解决农药残留所造成的危害问题提供生物学基础。1．材料与方法1.1土壤的土壤取自农药厂的排污水沟和附近的农田。1.2乙酰胆碱酯酶从家蝇头部提取。1.3培养基富集培养基()：NaNO32，KCl0.5,CaCl20.05，KH2PO41，MgSO4.7H2O0.5，pH7.0,使用前加入适量敌敌畏浓缩液。分离培养基()：KH2PO40.5，(NH4)SO40.5，FeSO4O.00

5、1g，K2HPO40.2，CaC120.005,MgSO4.7H2O0.2，使用前加入适量敌敌畏浓缩液。发酵培养基()：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl1.0，pH7.0。1.4　菌株的富集、驯化和筛选取2g土样于100m1富集培养基中，加敌敌畏至100mg/L，37℃振荡培养24h，所得菌液接入新的富集培养基中（接种量10），并提高敌敌畏浓度到200mg/L，24h后接入新的富集培养基中，敌敌畏终浓度提高至300mg/L，如此循环至培养液中敌敌畏浓度达到500mg/L。然后，将培养液接入分离培

6、养基（敌敌畏浓度为500mg/L）继续培养，一周后再移种一次。将富集所得菌液适当稀释，涂布于分离平板，观察是否有菌落生长，选择生长旺盛的菌落进行纯化。1.5敌敌畏降解酶粗酶液的提取用发酵培养基培养菌体，离心收集菌体，用0.02mol/L,pH7.0的磷酸缓冲液洗涤后再离心，用适量磷酸缓冲液悬浮所得菌体，用JY92-II型超声波细胞粉碎机破碎细胞（工作电压220V，工作时间10S，间隔时间15S，120个循环），离心所得上清液即粗酶液。1.6乙酰胆碱酯酶活性测定乙酰胆碱酯酶能分解靛酚乙酸酯(红色)为靛

7、酚(蓝色)和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通过吸光度变化值来测定酶活力。在试管中加入10μl乙酰胆碱酯酶，470μl0.02mol/L，pH7.0磷酸缓冲液，20μl2靛酚乙酸酯，混匀，37℃水浴中反应5分钟，加入500μl95％乙醇终止反应，测OD605，计算酶活力。1.7乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留在试管中加入470μl不同浓度的有机磷农药（对照管加dH2O）,10μl乙酰胆碱酯酶，混匀，于37℃水浴中反应10分钟，加入20μl靛酚乙酸酯，混匀，37℃反应5分钟，加入500μl95％

8、乙醇终止反应，测OD605。计算酶的抑制率，以农药浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标作出标准曲线。抑制率的计算公式为:I=(Uo一UI)/Uo×100其中Uo：未受抑制的酶活力，UI：受农药抑制的酶活力。1.8有机磷农药降解酶酶活力的测定取470μl粗酶液，加敌敌畏至1000mg/L，37℃反应30分钟，沸水中加热5分钟终止反应，然后用酶抑制法测定农药残留。酶活力单位定义：在37℃，pH7.0的条件下，每分钟分解0.1µg敌敌畏所需的酶量为一个酶活单位(U