一株产纤维素酶菌株筛选及酶学性质

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1、一株产纤维素酶菌株筛选及酶学性质摘要：以羧甲基纤维素钠为惟一碳源，从土壤中筛选出一株产纤维素酶的菌株ＸＷ－１３，其摇瓶培养液的ＣＭＣ酶活力为１５．０５μｇ／ｍＬ，滤纸酶活力为１５．１３μｇ／ｍＬ。酶学性质试验表明，该酶的最适反应ｐＨ７．０，在ｐＨ５．０～９．０时有较好的稳定性，酶活力保持６０％以上。该酶的最适反应温度为４０℃，在温度为２０℃时基本稳定，保温２ｈ仍有８０％以上的活力。在化合物浓度为０．２ｍｇ／ｍＬ的条件下，ＮＨ４＋、Ｎａ＋、Ｆｅ２＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋和Ｌｉ＋对酶活力有增进作用，Ｈｇ＋和Ｃｕ２＋对酶活力有抑制

2、作用。关键词：产纤维素酶菌株；筛选；酶学性质中图分类号：ＴＱ９２０．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）08－1566-0313纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，是植物通过光合作用储能的主要形式［１］。关于土壤中纤维素酶的研究为充分利用纤维素提供了一条广阔的途径［２］。目前关于纤维素酶的研究报道集中于真菌与细菌方面，真菌主要以木霉为主［３－６］。纤维素酶是一类可以水解β－１，４葡萄糖苷键，使纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一个酶系的总称［７］。该酶系是由葡聚糖内切酶（Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＧ，ＥＣ３．２．１．４）、葡聚糖

3、外切酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＣＢＨ，ＥＣ３．２．１．９１）、β－葡萄糖苷酶（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＢＧ，ＥＣ３．２．１．２１）３个组分组成的诱导复合酶系［８］。目前，纤维素酶的应用日益广泛，而纤维素酶高产菌却相对较少，因此高产纤维素酶菌株的筛选是关键问题之一［９］。从土壤中筛选到一株产纤维素酶的菌株，并对该菌株进行了产酶条件和酶学性质的研究，以期为纤维素酶产生菌的开发利用打下基础。１材料与方法１．１材料１．１．１土壤样品与化学试剂土壤样品采自树木种植地；化学试剂购于国药集团，均为分析纯。１．１．２培养基富集培养基：羧甲基纤维素

4、钠４．０ｇ，ＮＨ４Ｃｌ５．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ１．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４１．０ｇ，去离子水１０００ｍＬ，ｐＨ７．０～７．２。分离培养基：羧甲基纤维素钠４．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４．０ｇ，ＫＣｌ５．０ｇ，ＮａＮＯ３３．０ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０１ｇ，琼脂１８．０ｇ，去离子水１０００13ｍＬ，自然ｐＨ。种子培养基：羧甲基纤维素钠８．０ｇ，酵母粉５．０ｇ，蛋白胨３．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ５．０ｇ，ＫＣｌ５．０ｇ，ＮａＮＯ３３．０ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．０１ｇ，去离子水

5、１０００ｍＬ，自然ｐＨ。发酵培养基：羧甲基纤维素钠１５．０ｇ，大豆蛋白胨８．０ｇ，酵母粉４．０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１．０ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．２５ｇ，去离子水１０００ｍＬ，自然ｐＨ。ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０．０ｇ，酵母膏５．０ｇ，ＮａＣｌ５．０ｇ，去离子水１０００ｍＬ，ｐＨ７．０。ＬＡ培养基：ＬＢ培养基中加入１．８％的琼脂粉。１．２方法１．２．１纤维素酶产生菌的筛选与粗酶液的制备取１００μＬ土壤样品溶液置于富集培养基中，在３７℃培养２４ｈ，将富集液用无菌水梯度稀释，涂布于琼脂分离培养基上，倒置于３７℃恒温培养箱中培养２４ｈ，然后用刚果红染色法［８

6、］染色５ｍｉｎ，去离子水冲洗后放置５ｍｉｎ，观察菌落周围有无透明圈，若有透明圈则初步证明该菌株具有产纤维素酶的能力，挑取透明圈较大的单菌落进行划线，进一步分离纯化。将初筛得到的菌株接入种子培养基培养１２ｈ，以２％的接种量转接到发酵培养基中培养２４ｈ，然后4℃、１２０００13ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集发酵上清液为粗酶液。用ＤＮＳ法测定酶活力。１．２．２纤维素酶活力的测定纤维素酶（ＣＭＣ酶，滤纸酶）活力测定均参照２００３年９月１３日发布的中华人民共和国轻工行业标准《纤维素酶制剂》进行［１０］。酶活力定义：在上述试验条件下，1mＬ酶液水解底物产生相当

7、1μg葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位，以μg/mL表示。１．２．３酶学性质的研究１）最适反应ｐＨ。配制不同ｐＨ的浓度为０．０５ｍｏｌ／Ｌ的缓冲液，缓冲体系及其ｐＨ分别为：ＫＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ２．０）；甘氨酸－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ３．０）；柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液（ｐＨ４．０～５．０）；磷酸缓冲液（ｐＨ6.8～8．０）；甘氨酸-ＮａＯＨ缓冲液（ｐＨ9.0～10．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＯＨ缓冲液（ｐＨ９．０～１２．０）。在ｐＨ２．０～１２．０条件下进行酶活力测定。以酶活力最大值为１００％，在其他条件下测得的酶活力相对于最大酶活力的比例即为该酶的

8、相对酶活力［１３］。２）ｐＨ稳定性。将酶液与不同ｐＨ的缓冲液混合，４０℃保温３ｈ后测定剩余酶活力。３）最适温度。不同温度条