高产纤维素酶菌株的筛选及所产酶的应用研究

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级：__________UDC：___________高产纤维素酶菌株的筛选及所产酶的应用研究姓名：唐乐丽学号：2111540114院系：药学院学位类型：专业学位专业：药学研究方向：制药工程与技术导师：李荷教授论文提交日期：2018年3月29日论文答辩日期：2018年5月16日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文SCREENINGOFEFFICIENTCELLULASE-PRODUCINGSTRAINSAND

2、THEAPPLICATIONOFTHECELLULASECandidate：LeliTangStudentID：2111540114Affiliation：SchoolofPharmacyAcademicDegreeApliedfor：professionaldegreeofPharmacySpeciality：PharmacySupervisor：HeLiAssistantSupervisor：DayofDefence：May2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceut

3、icalUniversity052018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文高产纤维素酶菌株的筛选及所产酶的应用研究摘要现已发现的纤维素降解菌所产纤维素酶大部分酶活力不高，酶学性质无法满足工业上大规模发酵生产的必要，纤维素酶的价格居高不下，我国的纤维素酶大都依赖进口，自己的生产技术与生产效率不高。本论文从源头开始，在自然界纤维素丰富的环境中，筛选能够高效产纤维素酶的微生物。纤维素酶在多种领域都具有良好的应用，本论文分析了其在提取中药虎杖中有效成分白藜芦醇和白藜芦醇苷以及在水葫芦资

4、源化利用中的实际价值。从不同环境中通过刚果红染色初筛、酶活测定复筛，一共筛选出16株产纤维素酶的菌株，其中产生羧甲基纤维素酶活（CMCase）、滤纸酶活（FPase）和β-葡萄糖苷酶活（βGase）活力最大的分别是H-3、H-3和H-1菌株，酶活力分别为1538.44U/ml、212.87U/ml和115.14U/ml。选择其中3种水解圈较大、所产纤维素酶的酶活力较高的菌株（H-3、Z-1和Z-2菌株）进行16SrDNA基因序列分析，鉴定均为芽孢杆菌（Bacillus）。对3种菌株所产纤维素酶的酶学性质进行了分析，发现H-3、Z-1

5、和Z-2菌株所产酶的最适温度均为50℃，最适pH分别为5、4和5。3种菌株产生的纤维素酶耐热耐酸稳定性良好，在4℃-50℃保温4h后还有50%以上的剩余酶活；pH3-7处理4h后，剩余酶活力均在40%以上。3种菌株所产纤维素酶的酶学性质良好，通过合理运用可以提高其酶学活力。对筛选得到的高效纤维素降解菌——H-3菌株的发酵产酶条件进行了优化。利用单因素试验、Plackett–Burman实验设计和响应曲面设计对菌株产纤维素酶的发酵条件进行了优化。实验主要以CMCase为指标，评价了碳源、氮源、无机盐、起始pH值、接种量和装液量6个因素

6、对菌株产酶能力的影响，得出酵母粉、装液量和起始pH为主要显著性影响因素，通过Design-Expert软件分析出菌I广东药科大学硕士研究生学位论文株产酶最佳发酵条件是酵母粉含量为20.92g/L、装液量52.51mL、起始pH为6.69；发酵培养的其他条件分别为葡萄糖含量为14g/L、胰蛋白胨含量为22g/L、KH2PO4含量为6g/L、接种量10%；此时，菌株发酵产酶酶活力达1721.08U/mL，较优化前产酶酶活力提高了72.20%。利用纤维素酶对虎杖中有效成分白藜芦醇和白藜芦醇苷进行了提取。通过单因素试验，分析了加酶量、提取p

7、H、温度、酶解时间4个因素对白藜芦醇和白藜芦醇苷两种有效成分提取率的影响，得出提取白藜芦醇与白藜芦醇苷的最佳工艺条件均为加酶量8mL，pH为5.0，温度55℃，但酶解提取时间有所不同，白藜芦醇与白藜芦醇苷提取的最佳反应时长分别为4h和8h，此时提取率分别为6.85%、6.95%，分别比酶解前提高了2.70倍、1.46倍。本实验为以后纤维素酶在中药材中活性物质的提取应用方面提供了研究基础。为水葫芦的资源化利用，我们对纤维素酶水解水葫芦转化成葡萄糖进行了研究。经过单因素分析实验，以温度、底物量、反应pH4以及酶解时间4个因素，采用L9（

8、3）正交试验对纤维素酶水解转化水葫芦进行了分析，得到酶水解转化水葫芦的最佳组合为：温度50℃、底物量0.2g、反应pH为4.5、酶解时间8h，在此最佳组合下，水葫芦转化率达到97.16%，较加酶前水葫芦转化率53.26%，提高了1.8