产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定与产酶特性研究

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1、四川农业大学2008届硕士研究生毕业论文摘要利用脱苦酶实现蜜柚的脱苦，对营养成分无破坏，不影响或改变柚汁或蜜柚果酒的天然良好风味，是最理想和最具产业化应用前景的方法，也是目前该领域的研究热点。本课题以自然界得到的菌株为出发菌株，对脱苦酶中最主要的一种酶一柚菅酶的高产菌株筛选、菌种鉴定，发酵产酶的周期规律，酶活力检测方法的比较以及粗酶的基本性质进行了研究。本文首先对由本实验室从发霉的蜜柚果皮、腐烂柚果堆积处的土壤处分离筛选得到的共60株真菌菌株进行了筛选。柚苷酶是一种诱导酶，含柚皮苷粉或苦味物丙酮提取液的

2、培养基是该菌株的最佳诱导产酶培养基。采用透明圈法和平板划线法对菌株进行了初步的纯化分离，将所分离得到的纯菌株接种子以O．5％柚皮苷粉为产酶诱导物的选择性固体平板培养基上，28℃培养5d，通过观察其生长情况对菌株进行初筛；将初筛菌株接种到以0．5％柚皮苷粉为产酶诱导物的液体发酵培养基中，28℃、160rmp摇床培养5d，经台式中型低温离心机离心(3500rpm，15min)后取粗酶液，用Davis法测定酶活，筛选出一株实验室编号为P一61的菌株所产酶的酶活最高，为310．64，于是决定以该菌株做为后续研究

3、的目标菌株。通过对该菌株的有性观察、外观观察和显微镜观察得出结论：有性孢子不详或不发生，鉴定编号为P．61菌种为有性世代还未被发现的半知菌类(FungiImperfeetO。分生孢子穗球形，紫褐色至黑色，与丛梗孢科(Moniliaceae)，单孢亚科(A,nerosporoideaeofMoniliaceae)，曲霉族(Aspergilleae)，曲霉属(AspergillusMich．ex^)，黑曲霉组0．niger)的描述基本上相吻合，因此，鉴定为此株菌为黑曲霉。本实验对黑曲霉P-61的发酵产酶规律

4、进行了研究，对比了利用紫外分光光度计测定柚苷酶酶活性的Davis法和高效液相色谱法的优劣之处，在相同的发酵产酶培养条件下，通过对柚苷酶的发酵产酶培养基中还原糖含量、柚皮苷含量、柚苷素含量和柚苷酶酶活随培养时间增加而变化的趋势观察，得出结论：以柚皮苷溶液浓度1．59／L为为菌体生长诱导底物的液体发酵培养基的产酶情况最为稳定；用Davis法测定酶活速度快，但可能受到柚皮苷降解的中间产物的干扰，准确度较差，用高效液相色谱法测定酶活性，虽然前处理和开机操作比较烦琐，但测定结果的准确度较高，受到的干扰小。四川农业

5、大学2008届硕士研究生毕业论文最后，本实验对28℃、160rpm摇床培养5d后的培养液，于4"C，用冷冻离心机经5000×g离心15min得到的粗酶液的酶学性质进行了基础性的研究。确定采用二次沉淀法，先用30％的硫酸铵沉淀除去杂蛋白，再用60％硫酸铵沉淀盐析出柚苷酶。经过SDS-PAGE，确定了P．61菌株所产粗酶液5倍超滤浓缩后的分子量，约为100KDa。酶活性及稳定性随环境而变化，在pH4．0和温度为50℃时，酶的活性最高；溶液的离子种类对此黑曲霉P-61所产的酶活性有一定影响，Ca2+(5mol

6、／L)对此粗酶有相对较强的激活作用，Zn2+、K+、EDTA对酶有很强的抑制作用。关键词：柚苷酶、筛选、菌种鉴定、产酶规律、酶学性质四川农业大学2008届硕士研究生毕．业论文StudiesontheScreeningandIdentificationofStrainswithHighNaringinaseandItsEnzymeProdcuingCharacteristicsGuoQian(FoodScience)DirectedbyWuYinglong(Professor)、NiHui(Associa

7、teProfessor)AbstractThispaperconsiderstheutilizationofdebitteringenzymetoreducepomelo’Sbitternesswithoutdestroyingnutritionalcomposition．Noeffectoralterationtothenaturalgoodflavorofpomelojuiceorpomelowineiscaused．Itisthebestmethodofindustralizationapplic

8、ationforeground．Inaddition，itisalsoafocusresearchinthisfield．Thistopicusesthestrainsisolatedfromnatureastheoriginalstrains．Thisresearchfocuesononeofthemainenzymesofdebittering，enzyme-naringinase．Thisresearchentailsscreenin