产纤溶酶的海洋菌株的鉴定与产酶特性的研究

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1、分类号：密级：UDC：编号：河北工业大学硕士学位论文产纤溶酶的海洋菌株的鉴定与产酶特性的研究论文作者：米阳学生类别：全日制学科门类：工学硕士学科专业：生物化工指导教师：史延茂职称：研究员董超高级工程师DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiochemicalEngineeringIdentificationandcharacterizationofmarineactinomycetesstrainsproducingfibrinolyticenzymebyMiYangSupervis

2、or:ResearcherShiYanmaoSeniorEngineerDongChaoMay2016摘要纤溶酶是纤溶系统中的一个重要组成部分，它可以专一性的降解纤维蛋白凝结块儿。纤溶酶作为溶栓剂治疗血栓性疾病疗效好而且更加安全，目前已在临床上广泛应用。然而，现有的溶栓药物均有明显的副作用，开发一种副作用小的新型溶栓剂的意义重大。海洋放线菌由于其生长在异于陆地条件的海洋环境里，具有与众不同的生理特征和代谢途径，成为了获得新的生物活性物质的一个重要来源，所以从海洋放线菌资源中寻找纤溶酶，为人们寻找开发新型溶栓药物指明了一个新的方向。本文采用常规的分离筛选方法，在渤海海域采集的海水及海泥样

3、本中，筛选出了一株可以产纤溶酶的放线菌MY0504，综合对该菌株进行的形态学鉴定、生理生化鉴定以及16SrDNA序列分析构建系统发育树，确定该放线菌属于微白黄链霉菌（S.albidoflavus），其菌株及发酵液安全无毒。放线菌发酵液经高速离心去除菌体、40~60%硫酸铵饱和度盐析、截留沉淀复溶后透析，冻干制成粗酶品。取适量粗酶品溶解进行SephadexG-75凝胶过滤，分离纯化出了一种电泳纯的纤溶酶，经实验数据拟合公式计算和SDS-PAGE电泳检测，确定分子量大约为14~15kD。分离纯化过程中，从发酵液提取纤溶酶的纯化倍数为7.15倍，收率为32%。对放线菌产纤溶酶的酶学性质进行研

4、究，发现放线菌MY0504纤溶酶最适作用温度为37℃，在47℃以下酶活具有较好的稳定性；适宜pH为7~9，为偏碱性的蛋白酶，酶活最高的pH为8.0；Cu2+对其抑制作用显著，Ca2+有一定的促进效果；Aprotinin强烈抑制纤溶酶活性，PMSF(苯甲基磺酰氟)可以完全抑制该纤溶酶活性，初步推测该酶是一种丝氨酸蛋白酶。关键词：海洋放线菌纤溶酶纯化产酶特性IABSTRACTThefibrinolyticenzymeisanimportantpartofthefibrinolyticsystem.Itcanspecificlydegradefibrincoagulationpieces.F

5、ibrinolytictherapyisavailable,whichhasbeenwidelyusedinclinicalpractice.However,thecurrentthrombolyticdrugshavesomesideeffects,itisgreatimportanceofdevelopinganewtypeofthrombolyticagentwithfewsideeffects.Asmarineactinomycetesgrowintheparticularmarineenvironment,theypossessuniquephysiologicalchara

6、cteristicsandmetabolicpathways.Therefore,theybecometheimportantnewsourcestoscreennovelactivefibrinolyticenzymefrommarineactinomycetes.Afibrinolyticenzymeproducingactinomycetesstrain,namedMY0504,wasscreenedoutfromthemudandseawatersamplescollectedintheBohaiSea,usingconventionalseparationscreeningm

7、ethods.TheactinomycetesstrainwasidentifiedasStreptomycesalbidoflavusbymorphologicalidentification,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsand16SrDNAsequenceana1ysis.Thestrainandthefermentationbrothweresafeandnon-toxic.Thef