黄鳝III型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析.doc

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1、黄鳝III型Hepcidin基因cDNA克隆及序列分析　　摘要：以黄鳝为材料，提取肝脏总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因ｃＤＮＡ的开放阅读框及３′端非编码区序列，序列分析表明，黄鳝Ｈｅｐｃｉｄｉｎ含有一个２７３ｂｐ的ＯＲＦ，编码９０个氨基酸残基，有信号肽、前体肽和成熟肽。在前肽部分具有前肽转化酶典型的ＲＸＲ基元。同源性比对表明，黄鳝Ｈｅｐｃｉｄｉｎ与其他鱼类的同源性在４０％以上，是Ｈｅｐｃｉｄｉｎ抗菌肽家族的新成员。　　关键词：黄鳝；抗菌肽；Ｈｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡ克隆；序列分析　　中图分类号：Ｑ９５９．４８２；Ｑ７８５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114

2、06－1239-03　　　　CloningandSequenceAnalysisofTypeIIIHepcidincDNAfromRiceFieldEel　　ＬＩＷｅｉ，ＬＩＣｈａｎｇ－ｐｅｎｇ　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Hepcidin’sｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅａｎｄ３’ｅｎｄＵＴＲｗereａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｏｆｌｉｖｅｒｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌｂｙＲＴ－ＰＣＲａｎｄＲＡＣＥｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｂａｓｅｄｕｐｏｎｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅFJ436807ｉｎＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅ

3、ｃｌｏｎｅｄｃＤＮＡｗａｓ５８０ｂｐｗｉｔｈａ２７３ｂｐＯＲＦｅｎｃｏｄｉｎｇ９０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ａｐｒｏｄｏｍａｉｎａｎｄａｍａｔｕｒｅｐｅｐｔｉｄｅ．Thepropeptidecontainedthetypical.Relementofpropeptideinvertase，maturepeptidepartcontained6conservedcysteineresiduesthatcouldform3intrachaindisulfidebond.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｌｉｇ

4、ｎｍｅｎｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒHｅｐｃｉｄｉｎｓ，ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌHｅｐｃｉｄｉｎｓｈａｒｅｈｉｇｈｉｄｅｎｔｉｔｙof40%ｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｉｔｗａｓａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆHｅｐｃｉｄｉｎｆａｍｉｌｙ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｅｆｉｅｌｄｅｅｌ；ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ；Hｅｐｃｉｄｉｎ；ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ　　　　抗菌肽具有抗细菌、真菌、寄生虫和抑制肿瘤等重要生物学功能［１］。鱼类抗菌肽是鱼体天然免疫的重

5、要组成部分，其分子量小，合成速度快，在体内扩散迅速［２］。因此，抗菌肽产品在疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌和治疗药物，可作为抗生素添加剂的良好替代品在水产养殖业中发挥不可估量的作用。Ｈｅｐｃｉｄｉｎ是一种由肝脏合成的小分子肽，参与铁代谢，是调节铁代谢的重要分子，目前被认为是调节维持铁稳态极其重要的负激素。同时也有研究表明它们与许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似，具有显著的广谱抗菌活性［３］。其基因序列和蛋白结构在不同物种间高度保守，均富含精氨酸、赖氨酸等带正电的氨基酸残基和６个或８个半胱氨酸残基，形成二硫键结构，属防御素蛋白家族［４，５］。迄今为止，已知硬骨鱼牙鲆［６］，虹鳟［７

6、］，真鲷［８］，金眼石�l［９］，金头鲷［１０］，大西洋鲑鱼［１１］，鲶鱼［１２］，大菱鲆［１３］，斑马鱼［１４］，许氏平�O［１５］等都发现有Hｅｐｃｉｄｉｎ的报道。黄鳝是我国重要的名特优淡水产品之一，作为性发育和分化研究的重要材料备受关注，但对其抗病功能基因的研究缺乏报道。本研究成功克隆黄鳝Hｅｐｃｉｄｉｎ基因的ＯＲＦ和３′端ｃＤＮＡ片段，并推导出Hｅｐｃｉｄｉｎ蛋白的一级结构，旨为进一步研究Hｅｐｃｉｄｉｎ的功能及其开发应用奠定理论基础。　　１材料与方法　　１．１试验用鱼和总ＲＮＡ的提取　　健康成体黄鳝购于荆州老南门水产品市场。黄鳝肝脏取出后迅速冻存于液氮中，然后在－８０℃

7、超低温冰箱中保存。总ＲＮＡ的提取采用Ｔｒｉｚｏｌ一步法提取，方法按照说明书进行。取２μｇ的肝脏总ＲＮＡ进行反转录反应。ｃＤＮＡ合成采用Ｍ－ＭＬＶ反转录酶进行。合成的ｃＤＮＡ冻存于－２０℃下备用。　　１．２引物设计和ｃＤＮＡ的扩增　　ｃＤＮＡ合成利用Ｍ－ＭＬＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓ按照文献［８］的方法进行。根据其他报道鱼的Hｅｐｃｉｄｉｎ的序列设计了１对特异性引物ｍａｈｅｐＮ１和ｍａｈｅｐＣ１，用来扩增黄鳝肝脏ｃＤＮＡ。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃