梨S22RNase基因全长cDNA克隆与序列分析

《梨S22RNase基因全长cDNA克隆与序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、-------Wenzhou,ZHejiang325006；2TheKeyLabofNon-WoodForestProductofForestry Ministry,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology，ChangshaHunan 410004)Abstract:A840bpsequenceofS-RNasegenewasisolatedbyrapidamplificationof cDNAends.Sequencingresultsshowedthatthefragmentwas60%-90%similarityto thecD

2、NAsequencesofpearotherS-RNasealleles.Aopenreadingframecomprised by681bpencoding227aminoacidwasalsofound.Keyword:Pyruspyrifolia；self-incompatibility；Full-LengthcDNA；Cloning自交不亲和性是植物实现异花受精、防止近亲繁殖和退化的一种重要而精密的遗传机制[1,2]。梨自交不亲和是由单个基因位点（S基因位点）的复等位基因（S-RNase基因,简称S基 因）所控制[3,4]。日本学者于1995和1998年从本国的5个梨品种中分

3、离克隆到了7个S基 因的全长cDNA[5,6]，2002年又克隆了S8的全长cDNA[7]，2004年克隆到了S9的全长cDNA[8]。 国内新发现了30多个新的梨S基因，但绝大多数都为基因片段。对于全长cDNA序列的获得可以更好的研究梨自交不亲和S基因在mRNA水平上的差异，更好的获得其编码序列的真实情况，验证基因组水平上获得的S基因外显子的可靠性和内含子插入区域的准确性。作者用沙梨品种云南宝珠，提取雌蕊总RNA，并用RT-PCR和RACE技术获得了S22-RNase的全长 cDNA序列。本文报道了S22-RNase全长cDNA的获得和序列分析情况。1材料与方法1.1材料植物材料砂

4、梨（Pyruspyrifolia）品种云南宝珠雌蕊采自中国农业科学院果树所，置于液氮中带回实验室于-70℃保存待用。ExTaq、pMD18-TVector和3′-FullRaceCoreSet试剂盒购自日本TaKaRa公司,RNA抽提试剂盒购自invitrogen，回收试剂盒购自安比奥生物技术公司。其它药品购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.2方法1.2.1总RNA的提取参照RNA抽提试剂盒说明书，所用试剂用0.5‰DEPC处理过的无菌水配制。操作过程尽量避免RNase污染，耐高温器皿240℃烘烤4小时以上，其它器皿用0.5‰DEPC溶液浸泡过夜，然后高温灭菌处理，烘干备用。1

5、.2.2引物设计及cDNA全长获得参考GenBank上苹果、梨的mRNA序列，利用PrimerPremier5.0设计5′端特异引物为：PF2：5′-TGCCTCGCTCTTGAACAAA-3′和PF1：5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′，PF1位于PF2下游120bp左右处。反转录反应体系为10×RNAPCRBuffer1μl，MgCl2(25mM)2μl, dNTPMixture(各10mM)，AMVReverseTranscriptaseXL(5U/μl)0.5μl,RNaseInhibitor(40U/μl)0.25μl,Oligodt-3sitesAdapto

6、rPrimer(2.5μM)0.5μl,PositiveControlRNA(2×105copies/μl)0.5μl,RNaseFreedH2O。循环条件如下：30℃10min,50℃30min,95℃5min，5℃5min1个循环。 反应结束后，进行一下反应：10×PCRBuffer（Mg2+Free）4μl,MgCl2(25mM)3μl,TaKaRaTaq (5U/μl)0.25μl,PF2(10μM)1μl,3sitesAdaptorPrimer(20μM)0.5μl,上步的反应液10μl,灭菌水33.75μl.循环条件：94℃30sec，55℃30sec，72℃2min38

7、个循环。1.2.3目的片段回收、克隆PCR产物回收按照AmbiogenLifeTechLtd的PuprepGelExtractionKit操作，回收产物与pMD18-TVector(TaKaRa)过夜连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5a,涂布于含有IPTG、X-gal、Amp的LB固体培养基上37℃过夜。挑取白色单克隆于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜。抽提质粒DNA，送上海生工测序。-----------64-----------2