中国甲型肝炎病毒毒龙甲株全基因序列的cdna克隆及序列分析

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中国甲型肝炎病毒毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析中华霉驻千u临束病毒学杂志2001奸2川噩15童里塑:-Jl-iro…1.【,!1..中国甲型肝炎病毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析曹经瑗郭可謇詹美云列崇柏田厚文毕肚刺甲型肝炎是我国主要传染病之.经类一日途径传播甲型肝炎病毒cHAY)在组织培养中生长缓慢滴度低.限制了甲型册炎癌曲及诊断试剂的生J因此有必要克隆我国自己的14AV培因.为体外表达HAV抗原打下基础[IAV属小RNA病毒科肝病毒属,为无包膜的单链RNA病毒含有长约7.5kh的_F链RNA,5端有长的非编码区,3端有1lyA的尾巴.基因组古有一个长的Jr放读码框架编码2227个氨基酸的大蛋n.基因排列顺序为:5一NCR—Vp4一一vP3一VP1—2A一2B一2C一3A一3B一3C一3D一3NCR,其中VP4至VP[J』J嫱构蛋白区叉称P1区,2A至3D为非结啕蛋白区又称F2(2A一2C).P3(3A一3D)区.tLa.V只有一个血清型,结构蛋白抗原具有构型依赣性,抗原序州相对保守其中5NCR,2B,2C,3A及3'NCR医对细胞培养株的适应性有关,3c为蚩 白酶区.几乎切割多蛋白的所有位点3D匈RNA聚台酶区…我们对我周HAv坛甲抹全序列的eDNA克隆及序列进行分析,并与HMI75株.和MBB抹.以厦已发表的甲肝病毒龙甲株结构区基因进行r比较.l材料和方法【L材料及来源HAV龙甲抹系1981年自黑龙江省某患者的粪便中分离得到,在FRHK4细胞上传23代收获,病毒研究所肝炎病毒研究室保存.逆转录酶SuperScr[ptII购自美国G1BCOBRI.公司.脱氧棱苷三磷酸(dNIT),TaqDNA聚合酶,克崖质粒PGEM—T载体试剂盒及质奉研究受国家863高科技生物拄术领域基金责助(863一[02.10-02)作者单位:1012052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎病毒研究室粒提取试剂禽均为Pmmega公司产品同忙素S标I已睨氧腺营酸赔自Amer—sham公DNa.手I删序试剂盒购自美国USB生化试剂,RNAsin峋自lf#羹生物工程公司HAV克隆抗体致XLJ—Nue翦株均山瘸毒学研究所肝炎病毒研究窜提供I2引物的设计驶合成参照国外已发表的HAV序列(HM175.MBB株)设计引物.山赛盛生物上棒公司合成,引物序到和位置表l 13免疫吸附法捕获病毒粒和eDNA帕台成,扩增及克隆用抗HAV结构睦单克隆抗体包被05ml聚己稀管加入5O收获的病毒细咆悬液,37吸附I5h.PBS洗3遍加^24水.l05xSuperI1逆转录缓冲液.825mlol/LdNTP.I125pmoI/L负链引物95℃加热5mln裂解病毒.变性释放病毒RNA,立即置于液氮L丰l{5nin特取出溶化后,加入1lRNAsin1Jl逆转录酶,5flit42℃～45℃1__台成eDNA第1条链,再补加lf25Pm-I/L正链引物,1OL1%明胶39m木m液体石腊,95℃5min.55t2min.72℃2min,加O5酶,9435s,50～55凸.35s7260s,共30个循环I'CR产物经1%琼脂糖凝腔电泳分析,收与PGEM—T载体连接.转化XLI—Blue细胞,经蓝白斑筛选挑取白色菌斑提取质粒进行鉴定.14cDN.a.克隆的序列测定采用束端终止法烈链质粒直接测序.质粒经Pro—mega质粒纯化柱纯化,于工测序用USB测序盒.按说明书操作.自动测序在AB1377自动测序仪进行.I5eDNA序列分析重叠的eDNA序列片段输入电脑.经DNASIS,PROS1S等软件进行核苷酸,氢基酸序列分析,并与HM175抹,MBB抹5乏龙甲株结构区基因 简报进行比较2结果2.1HA~龙甲株生序列eDNA的一级结构HAV龙甲株全序列eDNa.的核背酸序_州见蹦1,接苷酸全长7484bp.5.端非编码区长为725bp,3端非编码区长为63l】【I,有l5个多聚A的尾巴.含一个长的开放读码框架,编码2227个氨基酸的大蛋白.编码起始位置为726个核苷酸.基因组具有A+r含量丰富的特征.其中^禽晕为29.1%,T含量32.9%,G含量为22.1%.C含量为15.9%,A+T=62%,G+C=38%符音FIAX,'基固组的特征.22HAV龙甲株基因cDNA核苷酸序列与HM175株和MBB株的比较由表2可见,龙甲株(KIC株)与HM175株核苷酸序列的同源性为95.f%,氨基酸序列的同源性为98.7%;与MBB株核苷酸序列的同源性为98.8%,氨基酸序列的同源性为986%.龙甲株5端非编码区(725bp)分别比HM175抹5.端非编码区(733bp)缺少8个核苷酸(125bp一132hp处),比MBB株5端非编码区缺少一个核苷酸(186bp处).与MBB株桉昔酸变异最大的部分在3非编码区以及3A.2C,2B,VP3区5NCR区,氨基酸变异最大的部分在3A2B.2C区与 HM175株桉苷酸变异最大的部分在2c,3A,VP3区,氨基酸变异最大的部分在3A,2B,2C区.23与已发表的部分I¨^株结构区肇固序列的比较梭苷酸序列的同谭性为966%,氨基酸序列的嗣源性为990%.3讨论本研究得到的HAVI1C抹核苷酸序列与MBB株(组织培养株)序列同源性较高,为98.8%,与HM175株为95.I%.中华实验和临床病毒学杂志2001丰F旦堕】鲞堕班(h?苎!』【!imlD…tuber2OO1.v01I5.H04围I甲肝病毒龙甲株{=序列eDNA的桉苷醴序列(:蛋白翻译起始位点)FIg.1TlIe∞plelecDNA…leotid…eqenc…rhepa'St[…A丌】sLJcslIL一:Tttmslafi.n洲codor)mⅢmⅢmmⅢ嚣ⅢⅢmmⅢ一怒慧嚣～中华实验和临床病毒学杂志2001午】2月第l5卷第4期ChinesJECliVim[,Dem2001,v15.No4表1cDNA合成所用引物Tab.1PrimersusedforeDNAsynthesis表2HAVLJC株与MBB株及HM175株接苷酸及氰基酸序列同源性的比较(%)Tab.2ComparisonofnueleotideandaminoacidqunceshomologyamongLIC.MBBandHMI75(%)氨基酸序列弼源性与MBB盟HM175株差别不是很大.分别为98.6%和987%. 这附台HAV的特征.HAV只有一十血清型,抗原结构相对稳定根据文献[5]报道的HAV基因分型结果,HM175受MBB株同属于lB亚型,同一亚型问棱苷酸序列同源性大于92.5%.同一型间核苷酸序列同源性大于85%,本实验得到的HAVUc株也属于1Bl咂型.HAV经细胞传代后.2B,2C,3A区变化对HAV的细胞培养适应性有关,得到的[JC株基因变异晟大的也在这些区域,在2B区3889位丙氨酸到颉氰酸的变化是组织培养株的共同特性.培养7代与培养23代的13C株病毒结掏区棱苷酸序列有些变化(同源性966%),但氨基酸序列变化不大(同源性990%).参考文献1Im口SMHepatitisAvies:…meo~epts口fthed郫d盯virology,immmmbiology且ndapp~hest0vaeci~developm~lR~,iewsMedv11992.2:73—872C….iiTicehutmPmedlRH.etai.(~iplebe~cleotideseofwild-ty~hepatitisA……DlhdⅢe弛mgn日hep6自Av~'usandlp…-vBJ1,6I:50-593PadAV.1讪H.He【『口KVD.dalTheeml弛nuelec~ide§qIl…oftILg即0meofhumanh~IxstitisAvires(i~laleMBB)VirusRe—seh.1987.8:153—171 4田厚文.郭可謇,羽崇柏.甲型肝炎病毒龙甲株结构区基因eDNA序列分析及其克隆病毒,1994,10:300-3065RohertsonBH.1ansenRWKb—B,da1.GeneticmtatednesshepatitisAvirusstmi~Ⅱ…dfromdifferentge~calTq0nR.J(nVird.1992,73:1365—1377(收稿日期:2001.03—12)?读者?作者?编者?正确使用统计学符号根据国家'统计名词及符号》的规定,算术平均数用英文小写斜体j;标准差用英文小写筘}体;标准误用英文小写s加下角,即;l检验用英文小写斜体t;F检验用英文大写斜体F;卡方检验用希文小写斜体;相美系数用英文小写斜体,自由度用希文小写斜体(组);概率用英文大写斜体P;样本数用英文小写斜体n.《中华实验和临床病毒学杂志》编辑部