株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析

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中国农学通报2010,26(14):8-12ChineseAgriculturalScienceBulletin3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析1,21,21,21,21,2杨维星，施少华，陈红梅，万春和，程龙飞，11131傅光华，林芳，林建生，苏敬良，黄瑜（1福建省农科院畜牧兽医研究所，福州350013；2福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州350013；3中国农业大学动物医学院，北京100094）摘要：为分析3株1型鸭肝炎病毒（DHV）的遗传变异和进化关系；采用RT-PCR和5'-/3'-RACE.方法测定3株1型鸭肝炎病毒全基因序列；研究结果表明，不含poly（A）尾巴的3株病毒的基因组全长为7691~7700nt，基因组均仅含一个长度为6750nt的ORF，625~627nt5'端非翻译区和325~328nt3'端非翻译区(UTR)。将3株病毒株与GeneBank公布的其他DHV-1全基因序列及小RNA病毒科的其他属代表病毒株进行序列分析表明，聚蛋白均被分割成为12个蛋白，其中VP1的变异性最大，180~187位为高变区。3株病毒与DHV-1参考毒株核苷酸序列同源性在93.7%~98.8%，氨基酸序列同源性在96.9%~98.8%，DHV-1各株在小RNA科病毒多聚蛋白氨基酸序列进化树上形成一个独立的进化分支；DHVs-1病毒间核苷酸和氨基酸仍较保守，它们在进化中可将其归为小RNA病毒科的一个新属。关键词：鸭肝炎病毒1型；基因组；序列分析中图分类号：S852.65+9.6文献标志码：A论文编号：2010-0256GenomicSequenceAnalysisofThreeStrainsofDuckHepatitisVirusType11,21,21,21,21,2YangWeixing,ShiShaohua,ChenHongmei，WanChunhe,ChengLongfei,1,21131FuGuanghua,LinFang,LinJiansheng,SuJingliang,HuangYu（1InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350013;2FujianAnimalDiseasesControlTechologyDevelopmentCenter,Fuzhou350013;3CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094)Abstract:Thisexperimentwasconductedtostudythegeneticvariationsandphylogeneticanalysisofthreestrainsofduckhepatitisvirustype1(DHV-1);ThecompletesequencesofthreeDHVs-1(FZ86,FZ99andFZ05)wereacquiredbyRT-PCRand5'-/3'-RACE;Theresultsshowedthatthefullgenomiclengthofthreestrainsviruswere7691-7700ntwithoutpoly(A)tail,including625-627nt5’UTR,followedbyalongopenreadingframe(ORF)of6750ntand325-328nt3’UTR.ThenucleotidesequencesanalysisofthreeDHV-1strainsandthecitedDHV-1isolatesshowedthattheirpolyproteinscanbecleavedinto12proteins.Inthe12polyproteins,theVP1polyproteinhadlargevariationofaa180-187.ThehomologiesofthreeDHVs-1andotherDHVs-1werewithin93.7%-98.8%,whiletheaminoacidhomologywere96.9%-98.8%.TheDHV-1strainsclusteredtogetherandformedaseparatedsublingewithothernumbersofthefamilyPicornaviridae;DHVs-1areconservedonnucleotideandamimoacid,andbelongtoanewgenusinthefamilyPicornaviridae.Keywords:duckhepatitisvirustype1;genome;sequenceanalysis基金项目：国家自然科学基金“鸭肝炎病毒基因组结构研究”（30471283）。第一作者简介：杨维星，女，1984年出生，湖北潜江人，硕士，研究方向为动物传染病学。通信地址：350013福建省福州市新店埔党，Tel：0591-87572396，E-mail：xingxinger86@163.com。通讯作者：黄瑜，男，1965年出生，江西宁都人，博士，研究员，主要从事动物传染病研究。通信地址：350013福建省福州市新店埔党，Tel：0591-87572396，E-mail：huangyu_815@163.com。苏敬良，副教授，E-mail：jinglsu@yahoo.com。收稿日期：2010-1-26，修回日期：2010-03-21。 杨维星等：3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析·9·0引言U/μLRibonucleaseInhibitor1μL，200U/μLM-MLV鸭肝炎(DuckHepatitis,DH)是由鸭肝炎病毒ReverseTranscriptase1μL，混匀后按以下程序进行(DHV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害RT：30℃10min，37℃60min，99℃5min，保存于3周龄内雏鸭，以肝炎为特征。该病发病急、病程短、4℃。取2μL反转录产物，5×Buffer5μL，2.5mmol/L[1]发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业健康发展。dNTPmixture2μL，MgCl22μL，上、下游引物（20DHV分为1型、2型和3型，其中1型呈世界范围分pmol/μL）各1μL，Taq酶0.25μL，ddH2O补齐至25μL[2]布。在中国，最早于1958年发生鸭肝炎。近年来，印后按以下程序进行PCR：94℃5min，94℃1min，度、埃及和美国相继报道了1型DHV的变异情况。50~55℃1min，72℃1min，共35个循环，最后72℃1型DHV是一种无囊膜单股正链的RNA病毒，目10min，保存于4℃。PCR产物用1.0%（W/V）琼脂糖[2-3]前归属于小RNA病毒科的未确定种，其基因组大小凝胶电泳检测。约为7690nt，具有1个大的开放阅读框，编码1个有21.55’和3’末端的扩增249个氨基酸的聚合蛋白；3’UTR长度约为314bp，5’基因组的5’和3’末端的扩增按5’-FullRACEUTR长度约为626bp。1型DHV多聚蛋白具有11个CoreSet和3’-FullRACECoreSet说明书进行。切割位点，且具有与小RNA病毒相似的切割位点和保1.6克隆与测序[4-5]守基序。1型DHV与双埃柯病毒属(parechovirus)的用DNA快速回收试剂盒纯化PCR产物，连接至关系相对比较密切，但认为1型DHV可能属于小RNApMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，在LB抗性培病毒科的一个独立的病毒属。养基中过夜培养后，经菌液PCR鉴定为阳性者，由通过对3株1型鸭肝炎病毒株进行全基因序列测Invitrogen公司完成测序。定，为进一步认识1型DHV的分子特征和研究该病毒1.7基因序列的拼接与分析遗传变异等方面提供资料。采用DNAStar的Seqman程序将序列测定结果进[6]1材料与方法行拼接，获得3株病毒株的全长基因组序列，将该序1.1病毒株列与GenBank中登陆的DHV-1序列进行比对，进行FZ86株为1986年分离于福建福州10天雏番鸭，DHV-1的同源性和遗传进化分析。暂命名为FZ86；FS99株为1999年分离于福建泉州82结果天野鸭，暂命名为FS99；FZ05株为2005年分离于福建2.1基因组测序结果与序列分析福州11天半番鸭，暂命名为FZ05。根据各片段间相互重叠的区域，利用Seqman程序1.2主要试剂和仪器将3株病毒各基因片段的测序结果进行拼接，得到3株RNA提取试剂、M-MLV反转录酶购自Invirtogen病毒的全基因序列。不含poly（A）尾巴的3株病毒的公司，Taq酶和pMD18-T载体、5'-FullRACECoreSet基因组全长为7691~7700nt，基因组均仅含一个长度和3'-FullRACECoreSet购自宝生物工程（大连）有限为6750nt的ORF，625~627nt5'端非翻译区和325~公司；其他试剂均为国内分析纯。梯度PCR仪为328nt3'端非翻译区(UTR)。3株病毒株拥有11个切割Eppendorf公司产品。位点，可产生3种结构蛋白（VP0、VP3、VP1）和8个非1.3病毒及RNA的提取结构蛋白（2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。在这取经3株病毒株感染的鸭胚尿囊液于8000r/min12种蛋白中，VP1的变异性最大，其中180~187位为高4℃离心10min以去除杂质，收集上清液。RNA提取变区，未发现参与病毒吸附的RGD序列，而被SGD序根据TRizol说明书操作，最后每250μL尿囊液的病毒列所取代（见图1）。RNA用20μLDEPC水溶解。2.2聚蛋白切割位点预测[7-8]1.4RT-PCR小RNA病毒多聚蛋白拥有内部连接位点，多处位点根据GenBank上登陆的DHV-1基因组序列，应用含有被3C所识别并切割的一级或三级结构元件。Oligo6.0软件设计引物。反转录按M-MLVReverseCLUSTALW结果表明，3株病毒与LV聚蛋白的氨基Transcriptase说明书进行，具体如下：将制备好的酸同源性最高（30.7%~30.8%），因此通过比较这3株病RNA5μL，加入200pmol/L随机引物1μL，M-MLV毒与LV聚蛋白氨基酸序列来预测这3株病毒的聚蛋RT5×Buffer4μL，2.5mmol/LdNTPmixture8μL，40白切割位点。预测切割位点Q/G位于VP0/VP3、VP3/ ·10·中国农学通报http://www.casb.org.cn图13株病毒与DHV-1之间VP1蛋白比较VP1、2C/3A、3B/3C和3C/3D，Q/S位于2A/2B、2B/2C同源性为93.6%~96.7%，多聚蛋白氨基酸序列同源性和3A/3B，而VP1/2A切割位点则是E/S。在3株为96.9%~98.8%。FS99与FZ86和FZ05的全长核苷酸DHV-1的2A蛋白上有典型的口蹄疫病毒样切割位点序列同源性分别为95.7%和93.7%，多聚蛋白氨基酸序NPG|P，在此位点上可将2A蛋白切割成结构不同2A1列同源性分别为97.8%和97.4%，FZ86与FZ05的全长[7]和2A2，此预测结果与Kim等的报道一致。正如核苷酸序列同源性为94.2%，多聚蛋白氨基酸序列同Ljungan病毒和多数小RNA病毒VP4/VP0的N端存在源性为97.2%（见图2、图3）。[8]豆蔻酰化信号序列(Gxxx[S/T])，x为非保守氨基酸)对29株小RNA病毒科各属代表病毒和15株一样，在3株DHV-1的多聚蛋白前体位点L/G间(第DHV-1的全长多聚蛋白氨基酸序列进行种系进化30~31位)亦发现有该信号序列(GAVES)，据此推测3分析，结果显示，DHV-1各株在小RNA科病毒多聚株DHV-1的聚蛋白的N端均存在一个长度为30aa的蛋白氨基酸序列进化树上形成一个独立的进化分前导蛋白(Leaderprotein，L)。因此，3株病毒的基因组支，相比于其他小RNA病毒，该分支与双埃柯病毒结构为：5'UTR-L-VP0-VP3-VPl-2A1-2A2-2B-2C-3A-3属（Parechovirus）亲缘关系较近，然而DHV-1与LVB-3C-3D-3'UTR。和HPeV的多聚蛋白序列同源性也低于30%，显示2.3遗传进化分析DHV-1可能是小RNA病毒科的一个新属病毒（见FZ86与DHV-1参考株全长核苷酸序列同源性为图4）。94.3%~98.4%，多聚蛋白氨基酸序列同源性为97.1%~3讨论98.8%；FS99与DHV-1参考株全长核苷酸序列同源性通过对福建分离的3株不同时期1型鸭肝炎病毒为93.7%~97.6%，多聚蛋白氨基酸序列同源性为株基因组进行克隆测序，分析发现3株DHV-1基因组97.2%~98.8%；FZ05与DHV-1参考株全长核苷酸序列具有典型的小RNA病毒特征，如基因组仅含有一个大ZJHDHV1-GSFZ86E53SDFZZ05FZ05R85952A66C80JXmRNA03DFS99DRL-6258862.520NucleotideSubstitutions(×100)图23株病毒与参考株多聚蛋白氨基酸进化分析 杨维星等：3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析·11·A66JXmRNAC8003DZJHDHV1-GSE53SDFZ86FZZ05FZ05R85952DRL-6258865.2420NucleotideSubstitutions(×100)图33株病毒与参考株全长核苷酸进化树03DFS995886DRL-62.FZZ05FZ05R85952ZJHDHV1-G3DHV-1E53FZ86SCA66C80JXmANAHPeV1HPeV6HPeV2ParechovirusHPeV4HPeV3LV174FLV87-012LVM1145HepatovirusAEVHAVHEV-BHEV-DSEV-AEnterovirusHEV-CPVBEVPEV-BHEV-AHRVHRV-BRhinovirusPEV-AEnterovirusEMCVThVCardiovirusERAVAphthovirusFMDVERBVErbovirusPTVTeschovirusAivBKVKobuvirus208.6200150100500图4DHV-1与参考株及小RNA各属代表株多聚蛋白氨基酸比对进化树的开放阅读框、5’和3’末端为非翻译区、3’末端带有在3株DHV-1的2A蛋白上有典型的口蹄疫病毒一个Poly(A)尾巴，这3株病毒多聚蛋白存在11个切割样的切割位点NPG|P，和LV类似，DHV-1的2A蛋白由[7]位点，可被切割为12个成熟产物等结构。通过基因组结构不同的蛋白组成，预测结果与Kim等的报道一核苷酸序列建立的进化树分析发现DHV-1在小RNA致，即DHV-1的2A蛋白是由2种不同的2A小蛋白[9-10]病毒科的多聚蛋白进化树上形成一个独立的分支，这（2A1和2A2）串联而成。而Tseng等则认为，除了[8]一结果与Tseng等的研究结果基本一致，显示可能是形成一种成熟的蛋白（2A2）外，2A还形成另一种成熟小RNA病毒科的一个新属病毒。蛋白（2A3）。对于FMDVVP1蛋白大部分暴露在病毒 ·12·中国农学通报http://www.casb.org.cn的表面，是决定病毒抗原性的主要成分，能诱导动物产[5]黄显明,张小飞,魏建忠,等.1型鸭肝炎病毒的研究进展[J].动物医生中和抗体，也是抗原性的高变区。一般认为，衣壳蛋学进展,2007,28(11):78-81.[6]ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,etal.TheCLUSTALX白VP1上的RGD序列是细胞表面受体的配体，是小windowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequenceRNA病毒科病毒侵染细胞所必需的，但DHV-1没有此alignmentaidedbyqualityanalysistools[J].NucleicAcidsRes,1997,RGD序列，取而代之的是SGD，这是否说明DHV-1有25(24):4876-4882.自己独特的配体有待这一步研究。[7]KimMC,KwonYK,JohSJ,etal.RecentKoreanisolatesofduckhepatitisvirusrevealthepresenceofanewgeno-andserotypewhencomparedtoduckhepatitisvirustype1typestrains[J].Arch参考文献Virol,2007,152(11):2059-2072.[1]SandhuTS,CalnekBW,ZemanL.Pathologicandserologic[8]ChowM,NewmanJF,FilmanD,etal.MyristylationofcharacterizationofavariantofduckhepatitistypeIvirus[J].AvianpicornaviruscapsidproteinVP4anditsstructuralsignificance[J].Dis.1992,36(4):932-936.Nature.1987,327(6122):482-486.[2]郭玉璞,蒋金书.鸭病[M].北京:北京农业大学出版社,1988:30-31.[9]TsengCH,TsaiHJ.Molecularcharacterizationofduckhepatitis[3]DingCY,ZhangDB.Molecularanalysisofduckhepatitisvirusvirus[J].VirusRes,2007,126(1-2):19-31.type1[J].Virology,2007,361:9-17.[10]TsengCH,KnowlesNJ,TsaiHJ.Molecularanalysisofduck[4]KuhnR,LuzN,BeckE.FunctionalanalysisoftheinternalhepatitisvirustypeⅠindicatesthatitshouldbeassignedtobeatranslationinitiationsiteoffoot-and-mouthdiseasevirus[J].JVirol,newgenus[J].VirusRes,2007,123(2):190-203.1990,64(10):4625-4631.