dmrt1基因cdna序列的克隆及分析

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1、Dmrtl基因cDNA序列的克隆及分析Dmrt1基因是参勾•生物发育基因家族Dmrt(Double-sexandMab-3relatedtranscriptionfactor)家族的秉要成员，是第一个在人类中克隆得到的含DM结构域的基因。由于该基因参与脊椎动物性腺发育而引起人们的广泛关注(Raymondetal.，1998)，该基因的缺失可能引起雄性不育或性逆转(Raymondetal.,1999a;Raymondetal.,1999b;Calvarietal.,2000;0ttolenghietal.,2000)。家鼠，红耳龟，

2、密西西比鳄，红鳟鱼，籼皮蛙等物种的Dmrtl基因表达研究显示，在生殖嵴分化时期，正在分化的精巢屮表达量远高于卵巢中的表达董(Raymondeta1.,1999a;Raymondetal.,1999b;Kettlewelletal.,2000;Torresetal.,2002;Smithetal.,1999;Marchandetal.,2000;Shibataetal.,2002)。杏趣的是，青锵鱼Dmrtl在成熟个体的精巢、卵巢和脾屮都有表达(Ohmuro-Matsuyamaetal.，2003)。两栖炎在进化中是从水生到陆生的过

3、渡夹型，具冇特化的形态特征和功能，以适应不M的生活环境(费梁，1999)。两栖类的染色体组型呈现多样性,有的是XX/XY型，有的是ZZ/ZW型,有的是0W雌性/00雄性，还有的是XX/XY和ZZ/ZW同种共存(Schmidetai.,2001)。其性别决定和分化的机制很复杂，既不同于哺乳类和鸟类典型的基W型性别决定(GSD,geneticsexdetermination),也不同于爬行类环境型性别决定(ESD,environmentalsexdetermination)o环境因素、遗传因素(包括性染色体和性别决定相欠基因)、还有类

4、固醇等性激素都影响两栖动物性別决定与分化(周林燕等，2004;黄敏毅等，2004)。黑斑蛙(Rananigromaculata)俗称青蛙，隶属两柄纲(Amphbia)，无尾目(Anura)，蛙科(Kanidae)，足一广布种(陈娥辉，1991)。黑斑蛙的雌雄个体间没有发现异型染色体(陈壁辉，1991)。那么究竟该物种是怎样进行性别决定和分化的呢？作为性别决定候选基因，Dmrtl菽因在该物种中参与性别决定与分化吗？如果该菽因是黑斑蛙的性别决定菽因，那么定位于该物种的哪条染色体上呢？它在黑斑蛙的性別决定分化中又扮演什么角色？为了解答这

5、些问题，首先我们要获得黑斑蛙Dmrtl基因序列。本实验室季代丽等(2005)通过KT-PCK已经获得了黑斑蛙Dmrt1的DM结构域序列，卯检测不同组织的DmrtlmRNA的表达景，显示出该基W在成体黑斑蛙的精巢组织屮柯特异表达。为了进•-步探究黑斑蛙Dmrtl的功能，我们提取了黑斑蛙精巢组织的RXA,设计多对引物，采用H-PCR和RACE(5’-RACE和3’-RACE)技术，首次获得了黑斑蛙Dmrtl基因的企长cDNA序列，以期为探究黑斑蛙性别决定分子机制提供分子资料。实验设计1.2主要试剂RNA提取试剂盒(TrizolReag

6、ent,Invitrogen)；cDNA文库构逮试剂盒(SMARTTMcDNALibraryConstructionKit,Clontech)；lOObp梯度Marker购AV-gene；DL2000Marker是Takara公司产品;LA-Taq酶和去除RNA中的基因组DNA试剂盒购自Takara公司;DEPC(二乙基焦碳酸盐)。1.3实验器材处理所冇玻璃器皿(包括匀浆器、fi筒、广UI瓶等)和金属器材(包括解剖盒、解剖剪、解剖刀、解剖针等器材)，经肥皂水浸泡刷洗，流水冲洗，蒸馏水洗涤，再经1%oDEPC溶液37°C浸泡过夜，高

7、温高压灭菌后，20CTC烘烤；Eppendorf管和枪头等耐高温高压的塑料制品，经蒸馏水洗涤后，用0.1%oDEPC溶液37°C浸泡过夜，再经高温高压灭菌，•去除残衍DEPC,70-80°C烘干；电泳槽等不能高温火菌的槊料制品，经肥皂水浸泡刷洗，流水冲洗，蒸馏水洗涤,再经1%>DEPC溶液浸泡4小时以上，再用1%ODEPC处理的缓冲液TBE或TAE冲净，烘干。1.4精巢组织总RNA的提取按照TrizolReagent的操作说明，収黑斑蛙雄性性成熟个体，活体解剖后，迅速分离精巢组织，置于DEPC处理过的、冰预冷的匀浆器屮，用解剖剪充

8、分剪碎，加RNA提取试剂lmlTrizol,迅速匀浆至匀质进行卜*列步骤。(操作过程必须带手套、U罩，以免RNase污染；提取中所用的器具和溶液都耍保证无RNase)。(1)RNA分离匀浆液转移至DEPC处理过的EP管中，室温静H5分钟；加0.2m