小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

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1、万方数据中国畜牧兽医2011年第38卷第11期生物技术·77·小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析王磊1’2．3，王照2，．．李天松h2。刘玉秀1，冯娜1’3。王胜乐1,2，许薇薇1’2．姜雪h2，高玉伟I．3．王铁成1’3，杨松涛∽，夏咸柱1·3(1．中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062；2．吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130062；3．吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春130062；4．吉林省地方病第一防治研究所，吉林白城137000)摘要：本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热

2、病毒(caninedistempervirus，CDV)基因组迸行全序列测定，并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物，以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板，RT-PCR进行分段扩增，并克隆到pEASY-BluntSimple载体中，经测序、拼接获得全长eDNA序列。结果显示，小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AFl64967、EU716337、EU726268、AY

3、443350、AB474397、GUl38403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86．6％、92．4％、92．5％、92．5％，94．3oi／、96．3％、95．9％、87．1％、94．5％、92．3％、87．4％和94．6％，与标准强毒株A75／17株(AFl64967)的亲缘关系最近，全基因同源性达96．3％，但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远，同源性为86．6％。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示。小熊猫源犬瘟热病毒属于AsiaI型，H蛋白中3

4、09—311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点，为疫苗株没有而野毒株所共有的，并且可能与病毒的免疫原性有关。因此，致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。关键词：犬瘟热病毒；全基因测序；序列分析中国分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1671—7236(2011)11-0077-06犬瘟热是由犬瘟热病毒(caninedistempervi—rus，CDV)引起多种动物的一种急性、热性、高度接触性病毒性传染病。该病的传染性强，发病率高，临床症状多样，容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染(Marin等，2007)。近年来，随着中

5、国军犬、警犬、宠物犬及经济动物饲养量的大幅度增加，犬瘟热在中国的发病率和死亡率均有升高的趋势。对于经济动物和宠物来说，CDV经常引起大批宠物犬、貉、貂、狐等动物发病，犬病死率30％～80％，雪貂可高达100％，经济损失惨重(鞠会艳等，2010)。犬瘟热病毒系副黏病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，病毒基因组为单股不分节段、非重叠的负链RNA，约由15690个核苷酸组成。其基因组从31端到5’端依次为：3’端前导序列(3’leadersequence)、核衣壳蛋白基因(N)，磷蛋白基因(P)、基质膜蛋白基

6、因(蚴、融合蛋白基因(F)、血凝蛋白基因(H)和大蛋白基因(L)6个互不重叠的结构基因及5’端尾随序列(5’trailersequence)(Sun等，修回日期：201卜08·07作者简介：王磊(1986一)，男，河南人，硕士生，主要从事动物病毒学研究。通信作者：夏咸柱．中国工程院院士．Tel：86-431·86758799lE-mail：xia—xzh@yahoo．corn．cN基金项目：国家林业局野生动物疫源疫病调查项耳(2011001)．2008)。1997年军事兽医研究所病毒二室从病死的小熊猫体内分离出一株犬瘟热病毒，在细胞上对其进行了致弱驯化，

7、最后在犬身上进行安全性评价并取得较好的免疫效果。到目前为止，国内外尚未见关于小熊猫株犬瘟热病毒全长基因序列的报道，本研究旨在获得小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列，并与网上公布的犬瘟热病毒全基因序列进行比较分析，丰富犬瘟热病毒基因库，为后期反向遗传后备株的研究奠定基础。1材料与方法1．1病毒与试剂小熊猫源犬瘟热病毒、犬肾传代细胞系(DK)由军事兽医研究所病毒二室保存；E．coliTrans1一T1感受态细胞、高保真酶TransStartFastPfuDNAPolymerase、pEASY—BluntCloningKit购自北京全式金生物技术有限公司；2×Taq

8、PCRMasterMix购自北京天根生化有限公司；Sim—plyP总RNA提取试