《狐源犬瘟热病毒sd(14)7分离株全基因组序列分析及致病性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文狐源犬瘟热病毒SD(14)7分离株全基因组序列分析及致病性研究CompleteGenomeSequenceAnalysisofCanineDistemperVirusSD(14)7StrainOriginatedfromFoxandPathogenicResearch硕士研究生：孙彦刚指导教师：闫喜军研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：特产研究所研究生院2015年06月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCompleteGenomeSequenceAnalysisofCanineDistemperVirusSD(14)7StrainOriginatedfromFoxandPathogenicResearchM.S.Candidate：SunYangangSupervisorsProf.YanXijunDegree：MasterofVeterinarianSpecialty：VeterinaryMedicineJune2015 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年上月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，g卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年Jr月>/日导师签名:时间：M七年t月>/曰 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目狐源犬瘟热病毒SD(14)7分离株全基因组序列分析及致病性研宄动物传染病及其病论文作者孙彦刚专业兽医研宄方向原分子流行病学指导教师闫喜军培养单位（研究所)特产研究所姓名职称硕（博)单位专业签名评硕导口柳增善教授吉林大学微生物学博导■阅硕导口杜锐教授吉林农业大学预防兽医学人博导■答辩主席硕导口钱爱东教授吉林农业大学预防兽医学博导■硕导口军事医学科学院王兴龙研究员预防兽医学博导■军事兽医研究所硕导口■^^高丰教授吉林大学预防兽医学博导■答硕导■吉林省畜牧兽医傅殿国研究员预防兽医学博导口总站辩硕导■吉林特研生物技吴烕研宂员预防兽医学博导口术有限公司委员会议记录（秘书）范琳琳论文答辩时间地点2015年5月18日长春所区七楼会议室 摘要犬瘟热病毒（Caninedistempervirus，CDV）引起的犬瘟热（Caninedistemper，CD）虽然有有效的疫苗防控，但是还维持着高感染率和高死亡率，给养犬业、毛皮动物养殖业以及野生珍稀动物的保护带来很大危害。近年来，中国主要毛皮动物养殖区内时常发生犬瘟热，并且传染性强，致死率高，因此研究当前流行毒株的变异性和动物致病性，对犬瘟热的有效防控非常重要。本研究于2012～2014年从山东、河北、辽宁省收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料，克隆测序了15条F蛋白信号肽区（Fsp）基因序列、10条H基因序列和12条F基因序列。Fsp基因系统发育进化分析结果表明，15株CDV野毒株均属于中国当前流行的Asia-1基因型。H、Fsp、F2和F1氨基酸序列相似性分析显示，H和Fsp的变异率较高，F1其次，F2变异率最低。H和F基因系统发育进化分析显示，测序的毒株均属于Asia-1型，与疫苗株遗传距离很远。H和F氨基酸序列比对结果显示，大部分毒株H氨基酸出现了I542N和Y549H变异，潜在的N-糖基化位点数为10个，Fsp蛋白变异率很高。中国主要毛皮动物养殖区内犬瘟热的发生，不是由于疫苗毒株返祖毒株增强所致，可能与H蛋白Y549H变异、潜在的N-糖基化位点数目增加以及Fsp蛋白发生变异有关。采用Vero-SLAM细胞从山东省荣成市某养殖场疑似犬瘟热病毒感染狐狸的肺脏中分离得到1株病毒，经鉴定为CDV野毒株，命名为SD(14)7。克隆测序了SD(14)7的全基因组序列，并对其全基因组和H基因序列进行了分析。结果表明，SD(14)7株的全基因组序列长15690nt，与LN(10)1株的全基因组相似性最高为98.8%，与疫苗株的相似性较低为91.9%～92.2%。系统发育树分析结果表明，该毒株属于Asia-1型，为中国当前流行的CDV野毒株。对H氨基酸序列进行分析，发现SD(14)7株发生了I542N和Y549H的突变，潜在的N-糖基化位点为10个。为了阐明SD(14)7株对水貂、狐狸和貉的致病力，该研究使用SD(14)7株细胞毒攻击CDV抗体阴性的水貂、狐狸和貉。结果表明，狐狸对该毒株最敏感；水貂感染后也出现明显症状，但耐受时间较长；貉出现神经症状。从发病症状和组织病理变化来看，症状以眼鼻分泌物增多为主，剖检可见淋巴结出血或肿大、脾脏肿大有坏死点、肺脏炎症出血等，表明SD(14)7株主要感染淋巴组织和器官。组织切片和免疫组化结果表明，貉组织器官病变最严重，其次为水貂，狐狸较轻。貉的脑中可以观察到包涵体，并且3种动物的脑中均可检测到CDV，证明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。动物的体温变化无明显的“双相热”特征，于攻毒后3～7d和6～9d开始分别通过粪便和眼鼻分泌物向外界排毒，CDV在淋巴结中含量最高。本研究证明，SD(14)7株对淋巴结和淋巴组织的侵染能力最强，具有一定的神经嗜性，能够造成动物继发感染而死亡。关键词：犬瘟热病毒，分离，鉴定，全基因组，致病性III AbstractCaninedistemper(CD)causedbyCaninedistempervirus(CDV),isanacuteandhighlycontactingtransmitteddiseases.Althougheffectivevaccineprevention,CDtendstobehighlyinfectionandmortalityrateworldwide,thatbringshugeharmtotherareandfuranimals.Consequently,itisextremelyimportanttoresearchthevariationandpathogenicityofthecurrentepidemicstrain.InordertosurveytheprevalenceandgeneticvariationsituationofCDVinfuranimalsculturezones,suspectedsamplesinfectedbyCDVwerecollectedfromShandong,Hebei,Liaoningprovincesfrom2012to2014.AfterdetectedbycaninedistemperantigendetectionstripandRT-PCR,thepositiveoneswereusedtobeclonedandsequencedfor15Fspgenes,10Hgenesand12Fgenessequences.PhylogenetictreeanalysisofFspgeneshowedthatallofthestrainsofCDVbelongedtotheAsia-1genotype.AminoacidsequencesimilarityanalysisofH,Fsp、F2、F1indicatedthattheHandFspproteinshowedhighlyvariationwhiletheF1,F2showedlower.PhylogenetictreeanalysisofFandHshowedthatthesequencedstrainsbelongedtotheAsia-1genotype,whichwasfarawayfromvaccinestrain.AminoacidsequencesimilarityanalysisofHandFshowedthatHaminoacidofmoststrainshadmutationsofI542NandY549H,whichleadedthenumberofpotentialN-glycosylationsitestobetenandFspproteinhadhighervariation.TheoccurrenceofCDVinChinaprobablymaybecausedbythevariationofY549HinHprotein,theincreasednumbersofN-glycosylationsite,andthevariationofFspprotein,whileitwasnotcausedbytheenhancedatavisticvirulenceofvaccinestrains.ACDVstrainwasisolatedfromlungsamplesoffoxthatwaspossibleinfectedbyCDVfromanimalfarmsinRongchengcityofShandongprovince.AfteridentificationofRT-PCR,virusmorphologyobservation,indirectimmunofluorescencetest,andanimalregression,theisolatewasprovedtobeaCDVwildstrain,namedbySD(14)7.ThewholegenomewassegmentedamplificatedbyRT-PCR.Cloningandsequencing,thesegmentsweresplicedintoSD(14)7wholegenomesequence.AnalysisofwholegenomeandHgeneshowedthatthelengthofthewholegenomesequencewas15690nt,whichhadahighlysimilaritywithLN(10)1strain(98.8%),91.9%—92.2%similaritywiththevaccinestrains.PhylogenetictreeanalysisofthewholegenomeofSD(14)7strainandHgeneshowedthatSD(14)7strainbelongedtoAsia-1genotypeanditwasawildstraininprevalencecircling.AnalysisofdeducedaminoacidsequenceofHgenesshowedthatthereweremutationsofI542NandY549H.AincreasedlocusofpotentialN-glycosylationsiteoccurrencingin542—544,andthetotalnumberofN-glycosylationsiteswasten.InordertorevealthepathogenicityofSD(14)7strain,animalmodelswerevaluated.Theresultsindicatedthatthefoxshowedhighestsensitivetothisstrain;minkappearedobvioussymptomsafterinfection,buttoleranceforalongtime;theraccoondogshowedneurologicsymptoms.Fromthesymptomsandthehistopathologicalchanges,conjunctivitisandincreasedeyesecretions,tissuelesionsofbleedingorlymphnodeenlarged,withnecrosisofspleen,lunginflammation,bleedingandsoon.Theresultsshowedthatthemaininfectionwasinlymphatictissuesandorgans.BiopsyandIV immunohistochemicalresultsshowedtissuelesionofraccoondogwasmostserious,followedbymink,foxwaslighter.InclusionswerefoundinthecerebrumofraccoondogandCDVwasdetectedinthecerebrumoftheanimal,suggestingSD(14)7straincaninfectthenervoussystemTemperaturechangehadnoobviouscharacteristicsof“dualphaseheat”.CDVcanbedetectedinfecesandeyeandnasalsecretionsfrom3～7dand6～9dpostinfectionrespectively.Thelymphnodeshadthehighestlevelsofvirus.Thisstudyrevealedthatthestraincausedseriousinfectioninthelymphnodesandlymphoidtissueandleadedthehosttobeinfectedbyexternalenvironmentanddeath.Keywords:Caninedistempervirus,Isolation,Identification,Completegenome,PathogenicV 目录第一章引言...................................................................................................................11.1犬瘟热病毒综述.........................................................................................................11.1.1犬瘟热病原特性..................................................................................................11.1.2CDV的细胞受体..................................................................................................21.1.3CDV的流行病学..................................................................................................31.2犬瘟热病毒分子生物学研究进展.............................................................................31.2.1核衣壳蛋白（N蛋白）......................................................................................41.2.2磷蛋白（P蛋白）...............................................................................................41.2.3基质膜蛋白（M蛋白）......................................................................................51.2.4融合蛋白（F蛋白）...........................................................................................51.2.5血凝蛋白（H蛋白）..........................................................................................61.2.6大蛋白（L蛋白）...............................................................................................71.3犬瘟热病毒分离方法.................................................................................................71.3.1原代细胞..............................................................................................................71.3.2传代细胞..............................................................................................................81.3.3表达CDV细胞受体的细胞系............................................................................81.4本研究的目的和意义.................................................................................................8第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析..........102.1材料和方法...............................................................................................................112.1.1病料和病毒........................................................................................................112.1.2试剂....................................................................................................................112.1.3引物设计与合成................................................................................................112.1.4病料处理、病毒RNA提取及反转录..............................................................112.1.5疑似犬瘟热样品的RT-PCR检测......................................................................122.1.6Fsp、H和F基因的RT-PCR扩增....................................................................122.1.7Fsp、H和N基因的克隆和测序.......................................................................122.1.8序列分析............................................................................................................13VI 2.2结果...........................................................................................................................132.2.1疑似犬瘟热样品的RT-PCR检测.....................................................................132.2.2Fsp、H和F基因的扩增...................................................................................132.2.3CDVFsp基因的遗传进化分析.........................................................................152.2.4H基因序列与遗传进化分析.............................................................................162.2.5H氨基酸序列分析.............................................................................................182.2.6F基因序列与遗传进化分析..............................................................................192.2.7F氨基酸序列分析..............................................................................................222.3讨论...........................................................................................................................23第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析.............................263.1材料与方法...............................................................................................................263.1.1细胞、毒株及实验动物....................................................................................263.1.2主要试剂和仪器................................................................................................263.1.3病毒分离............................................................................................................273.2结果...........................................................................................................................293.2.1病毒的分离结果................................................................................................293.2.2病毒的RT-PCR鉴定结果.................................................................................303.2.3病毒形态观察结果............................................................................................313.2.4间接免疫荧光试验结果....................................................................................313.2.5动物回归试验结果............................................................................................323.2.6SD(14)7株全基因组分段扩增结果..................................................................333.2.7SD(14)7株全基因组拼接与分析结果..............................................................343.2.8SD(14)7株与GenBank登录毒株之间的相似性分析结果.............................343.2.9SD(14)7株全基因组的遗传进化分析..............................................................353.2.10SD(14)7株H基因的比对分析与系统发育分析...........................................363.2.11SD(14)7株H氨基酸序列分析........................................................................383.3讨论...........................................................................................................................383.3.1病毒的分离........................................................................................................38VII 3.3.2病毒的毒力........................................................................................................393.3.3SD(14)7株全基因组与H基因分析.................................................................39第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究.............................................................404.1材料和方法...........................................................................................................404.1.1试验动物和毒株................................................................................................404.1.2主要试剂和仪器................................................................................................404.1.3病毒TCID50测定..............................................................................................404.1.4阴性动物的筛选................................................................................................414.1.5动物的分组与攻毒............................................................................................414.1.6动物的致病性研究............................................................................................414.1.7动物组织的病理切片与免疫组化....................................................................414.1.8病毒RNA的提取和cDNA的合成.................................................................414.1.9荧光定量PCR测定病毒含量...........................................................................424.2结果...........................................................................................................................424.2.1病毒TCID50测定结果......................................................................................424.2.2动物的发病特征................................................................................................424.2.3发病动物的组织脏器病变特征........................................................................434.2.4动物组织的病理切片和免疫组化结果............................................................454.2.5动物的体温特征................................................................................................494.2.6动物的抗体效价................................................................................................504.2.7动物的排毒期....................................................................................................514.2.8CDV在血液内的含量........................................................................................524.2.9CDV在各组织内的分布....................................................................................524.3讨论...........................................................................................................................534.3.1动物的致病性....................................................................................................534.3.2动物的体温........................................................................................................534.3.3动物的排毒期与病毒在组织内的分部............................................................53第五章全文结论.............................................................................................................54参考文献.............................................................................................................................55VIII 附录1实验所用仪器汇总..............................................................................................62附录2实验所需溶液的配方..........................................................................................63致谢.................................................................................................................................64作者简历.............................................................................................................................65IX 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称CDCaninedistemper犬瘟热CDVCaninedistempervirus犬瘟热病毒FspThesignalpeptideoffusionproteinF蛋白信号肽区FFusion融合HHemagglutinin血凝素CPECytopathiceffect细胞病变效应ORFOpenreadingframe开放阅读框TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织感染剂量MabMonoclonalantibody单克隆抗体RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechainreaction反转录聚合酶联反应VeroTheAfricangreenmonkeykidneycells非洲绿猴肾细胞SLAMsignalinglymphocyteactivationmolecule信号淋巴细胞激活因子WBCWhitebloodcell白细胞L,LYMLymphocyte淋巴细胞dpidayspostinfection感染后的天数X 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1犬瘟热病毒综述犬瘟热病毒（Caninedistempervirus，CDV）引起的犬瘟热（Caninedistemper，CD），是一种急性、高度接触性传染病。犬瘟热在全世界范围内分布，虽然有有效的疫苗防控，但是还维持着高感染率和高死亡率（Carvalhoetal.,2012），给养犬业、毛皮动物养殖业以及野生珍稀动物的保护带来很大危害。1.1.1犬瘟热病原特性CDV的病毒粒子多呈圆形，或为不规则和长丝状形，其直径大约在120nm至300nm之间。33CDV在蔗糖中的浮力密度为1.180～1.218g/cm，峰值为1.195g/cm。CDV的核衣壳外部由一层囊膜包裹（如图1.1），带有囊膜是副粘病毒科病毒的主要特征，它主要由病毒RNA和核衣壳蛋白组成。CDV囊膜上有一些杆状的纤突，它们只含有血凝素，并不含有神经氨酸酶。CDV只有一种血清型，CDV的流行范围很广，感染动物类型众多，这与CDV的血清型无关，研究表明可能与H和F等基因的变异有关。图表1.1麻疹病毒属病毒颗粒结构模式图Fig.1.1ThestructuremodelofMeaslesvirusparticles由于CDV含有囊膜，于是它对外界环境非常敏感，抵抗力很差。CDV对紫外线照射、有机溶剂、强酸、强碱等物质以及高温都很敏感，容易被甲醛、乙醚和酒精等机溶剂破坏囊膜，从而失去感染动物的能力。在临床上常采用3%氢氧化钠溶液和生石灰用于CDV消毒，可以达到较好的效果。强的光照和很高的温度也能使CDV灭活，这可能和犬瘟热在夏季较少流行有关。CDV一般保存于-80℃，这样可以使CDV免受温度的影响，同时也可以经快速冷冻干燥后进行长时间的保存。田克恭等（1998）研究表明，使用20%乙醇处理后放置4℃24h，pH为3.0状态下37℃1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言放置2h，以及60℃处理30min，都可以使CDV的毒价明显降低。刘双翼等（2004）使用4.8%氯仿处理后4℃放置10min，20%乙醚处理后4℃放置24h，60℃处理30min，都可以使毒价明显降低；pH为3.0状态下4℃放置2h，可使CDV完全灭活。1.1.2CDV的细胞受体1.1.2.1SLAM信号淋巴细胞激活因子（signalinglymphocyteactivationmolecule，SLAM，又称CD150）是活化的T淋巴细胞和B淋巴细胞、巨噬细胞以及树突状细胞表面的受体（WangNetal.,2004）,作为麻疹病毒属的免疫细胞受体（BaronMD,2005），在CDV感染免疫细胞的过程中起着重要作用。Tatsuo等（2000）通过将构建的表达人SLAM的质粒转染对麻疹病毒（MV）不敏感的细胞系，证明细胞表面表达SLAM使得不敏感细胞系能够结合MV，支持MV进入细胞，复制增殖，并产生病变，从而证明SLAM是MV的细胞受体。2001年，他们又用同样的方法，证明SLAM也是CDV和RPV的细胞受体，并发现SLAM作为这三种麻疹病毒属病毒的细胞受体没有宿主特异性（TatsuoHetal.,2001）。SLAM是SLAM家族的主要成员，属于免疫蛋白超家族，其细胞膜外结构包括细胞膜外的V区和C区（Veilletteetal.,2006），V区起着与H蛋白结合的作用（Onoetal.,2001）。Takao等（2011）通过结晶的方法，展示出了MV-H与SLAM受体相结合的结构，发现MV-H蛋白顶部的β折叠侧部与SLAM受体V区的β折叠相结合。Shimizu等（2013）通过同源建模，发现位于SLAM受体接触部分的32个氨基酸残基可能是与麻疹病毒属相结合的区域。在SLAM受体发现之前，分离CDV主要是使用Vero等细胞系。CDV疫苗株可以在这些细胞系中很好地复制增殖，但是野毒株在适应过程中往往会降低或失去毒力。自从SLAM受体鉴定为CDV的细胞受体以来，许多实验室构建了稳定表达SLAM的细胞系，并用于野毒株的分离，取得了很好的效果（Lanetal.,2005;Lanetal），大大促进了CDV的研究。1.1.2.2nectin-4多年来研究发现，CDV和麻疹病毒（MV）能够感染不表达SLAM受体的支气管上皮细胞，以及角质细胞，研究者猜测它们是通过未知的受体感染细胞的（Takeuchietal.，2003;Rivalsetal.，2007）。2012年Mühlebach等(2011)和Noyce等（2011）分别通过实验证明，nectin-4是麻疹病毒侵入上皮细胞的受体。nectin-4又称PVRL4，为nectin家族中的一员。nectin家族属于免疫球蛋白（Ig）超家族，至少由六个成员组成，即nectin1-4和脊髓灰质炎病毒受体（PVR）（Takaietal.,2008）。nectin家族的蛋白结构与免疫球蛋白相似，包括V区、2个C2区、跨膜区和胞质尾部。通过对麻疹病毒H蛋白与nectin-4受体结合位点的研究，证明H蛋白与nectin-4的V区相结合（Zhangetal.，2013）。Pratakpiriya等（2012）研究发现，野生型CDV可以在表达nectin-4的Vero细胞内高效复制，并形成合胞体，而在正常Vero细胞内不形成合胞体；用抗nectin-4抗体封闭表达nectin-4的Vero细胞后，Vero细胞没有内合胞体形成，从而证明nectin-4也是CDV的细胞受体。他们还证明了，nectin-4是上皮细胞的受体，并与CDV的神经毒力有关（Pratakpiriyaetal.，2012）。Noyce等（2013）也研究证实，CDV能够利用犬的nectin-4作为受体侵入宿主细胞，他们从犬的胎盘组织细胞或2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言MDCK细胞上鉴定了两个犬nectin-4突变体，它们之间最大的区别是一个突变体在胞质区缺失了20个氨基酸，但并不影响CDV侵入细胞。nectin-4有助于CDV侵入上皮细胞，并促进合胞体的形成。Otsuki等（2013）研究表明人的nectin-4可以作为CDV的细胞受体，而人的SLAM受体不能作为CDV的细胞受体，从而认为CDV拥有适应人类的潜能，并且未来可能在人类中产生严重的疾病。1.1.3CDV的流行病学犬瘟热一年四季均可以发生，但是以春、秋两个季节发病最多。犬瘟热感染后处于排毒期的动物，能够通过眼鼻分泌物和粪便尿液排出病毒，然后通过气溶胶或液滴进行接触传播。CDV的宿主范围很广，包括犬科、猫科、鬣狗科、鼬科、浣熊科、熊科和灵猫科等等，其宿主范围还在不断扩大。有报道称，伊比利亚猞猁（Melietal.，2010）、东北虎（Seimonetal.，2013）、黑熊（Cottrelletal.,2013）、狼（DiSabatinoetal.,2014）等濒临灭绝的珍稀动物感染CDV并死亡，给野生动物的保护带来很大挑战。2015年1月份，有报道称陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的大熊猫感染CDV，并造成大熊猫死亡，给中国的珍稀动物保护带来了很大挑战。在中国，由于养殖密度增大、跨区域频繁引种以及交通运输业的发展，造成犬瘟热频发，给中国的养犬业和毛皮动物养殖业带来很大损失。近年来有报道称，非人类的灵长类也能被CDV感染并致死（Qiuetal.,2011;Sunetal.,2010;Sakaietal.,2008;Sakaietal.,2013）。当前关于CDV宿主趋性的研究成为热点，目的在于研究CDV如何在不同宿主间传播，以及在什么情况下可以跨越人类屏障，而感染人类并致病。有学者认为，CDV之所以不能感染人类，是由于麻疹病毒（MV）刺激机体产生的免疫反应对CDV有交叉免疫保护作用，但是如果MV被消灭后，人体不能产生免疫保护，此时CDV就有可能感染人并致病（deVriesetal.,2014），从而成为继狂犬病之后第二大人兽共患病，将对人类健康构成很大威胁。1.2犬瘟热病毒分子生物学研究进展CDV属于副黏病毒科（Paramyxoviridaefamily），麻疹病毒属（Morbillivirusgenus），同属的病毒还包括麻疹病毒（MV）、牛瘟病毒（RPV）和小反刍兽疫病毒（PPRV）等（Diallo,1990）。CDV为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒（Beinekeetal.，2009）。其基因组长约16000nt，包括6个非重叠基因区，按3’-5’端顺序依次为前导序列、N、P、M、F、H、L以及引导序列，分别编码核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、附着或血凝蛋白（H）和大蛋白（L）6种结构蛋白（王琛等，2007）。P基因有两个重叠的阅读框，编码两种非结构蛋白：V和C蛋白，它们在抵抗宿主的免疫反应中起重要作用（Röthlisbergerelat,2010）。CDV含有两个跨膜糖蛋白，即血凝蛋白H和融合蛋白F。H蛋白主要起着与受体识别并结合的作用，F蛋白介导病毒囊膜与受体细胞质膜相融合。3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.2CDV基因组结构模式图1Fig.1.2ThestructuremodelofCDVgenome1.2.1核衣壳蛋白（N蛋白）N基因由1683个核苷酸组成，其开放阅读框位于108位与1679位之间，起始密码子为108～110位的ATG，终止密码子为1677～1679位的TAA，共编码523个氨基酸残基。N蛋白分子量约为58KDa。N基因具有很高的保守性，因此常用于CDV的分子生物学检测（Calderonetal.,2007;Kapiletal.,2008）。使用CDVN基因保守区域建立的RT-PCR（郭玲等，2012;Shinetal.,2004）和RT-LAMP（Choetal.,2005;胡嘉欣等，2012）方法，在CDV的检测中都起到了很好的效果。为提高PCR检测的敏感性，国内外科研工作者还建立了RT-nestedPCR（王凤雪等，2008；Shinetal.,2004），同样取得了很好的检测效果。通过疫苗株和野毒株之间不同的酶切位点，可以使用RFLP方法区分强弱毒株（Fischeretal.,2013;Wangetal.,2011）N蛋是CDV的主要免疫原性蛋白之一，具有较强的保守性，能够刺激机体产生很强的免疫反应。N蛋白可以分为三个不同区域，即氨基端的可变区域（氨基酸17～159）、中间的高度保守区域和羧基端的可变区域（氨基酸408～519）（Yoshidaetal.,1998）。N蛋白氨基端的80个氨基酸残基对其进入细胞核是必需的（Yoshidaetal.,1999），并且氨基端的空间结构区域和羧基端区域存在抗原表位，能被抗犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体识别（Masudaetal.,2006）。麻疹病毒属N蛋白与各自刺激机体产生的抗体之间可产生交叉免疫反应。（Örvelletal.,1974）Yoshida等（1999）通过将N基因截成多个不同片段，然后进行表达，并与制备的单克隆抗体反应，证明1～8位氨基酸残基和37～358位氨基酸残基为N蛋白的抗原表位，能够刺激机体产生抗体。1.2.2磷蛋白（P蛋白）P基因的开放阅读框包含1524个核苷酸，共编码507个氨基酸。副粘病毒的P蛋白是病毒RNA依赖的RNA聚合酶复合体不可缺少的一部分，在转录和复制的过程中起着多种作用（Curranetal.,1991;Curran,1996）。P基因上核苷酸的替换可以影响RNA的合成，P/V/C蛋白的改变与形成高水平的病毒子代有关（Rivalsetal.,2007）。P基因转录为mRNA后经RNA编辑可以生成V基因和C基因，两者编码两种非结构蛋白。在mRNA的编辑位点插入一个非模板化的鸟嘌呤核苷酸，产生一个与P基因mRNA有一个或两个核苷酸不同的mRNA，由于新产生的mRNA在开放阅读框的编辑位点的下游发生了改变，因此P蛋白和V蛋白的N末端区域完全相同，而C末端不同（Röthlisbergeretal.,2010）。V和C蛋白对病毒的毒力有很大的影响。（Devauxetal.,2004）V蛋白可以直接阻断干扰素感应过程，也可以通过调控病毒RNA的合成，从而间接地阻断干扰素感应过程，有助于麻疹病毒逃避宿主的免疫反应（Nakatsuetal.,2008）。Otsuki等（2013）研究发现，CDV007Lm株V蛋白的267位由半胱氨酸变成酪氨酸，而不能在H358细胞中复制。用表达CDVV蛋白的H358细胞研究表明，267位是半胱氨酸而不是酪氨酸的V蛋白，能够有效阻4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言碍干扰素介导的信号传导途径，使得CDV007Lm可以在H358细胞中复制，还证明V蛋白对于CDV在人上皮细胞中复制是有用的，并且是必不可少的（Otsukietal.,2013）。Otsuki等（2013）研究发现CDVAc96I株含有被截短的C蛋白，使其几乎不能在表达nectin-4受体的人上皮细胞NCI-H358中复制，但是CDVAc96I能很快适应NCI-H358细胞，出现这种现象，不是由于H蛋白的氨基酸发生了改变，而是由于含有完整C蛋白的Ac96I株亚群在NCI-H358细胞中生长。与含有被截短的C蛋白的CDVAc96I株相比，含有完整C蛋白的其他CDV毒株能够在NCI-H358细胞中高水平复制，证明C蛋白对于CDV在人上皮细胞中复制起着关键作用（Otsukietal.,2013）。1.2.3基质膜蛋白（M蛋白）M基因大约由1442个核苷酸组成，共编码335个氨基酸。如Onderstepoort株，其开放阅读框位于第3432碱基与第4439碱基之间，起始于3432～3434的起始密码子ATG，终止于4437～4439的终止密码子TAA。基质膜蛋白（M蛋白）位于核衣壳蛋白与病毒囊膜之间，将两者连接在一起。Dietzel等（2011）构建了一种野生型CDV重组体，此重组体带有疫苗株Onderstepoort株的M蛋白，研究表明：CDV疫苗株的M蛋白不会影响野生型CDV的合胞体的表型以及生长特征，但改变了病毒颗粒数与感染性之间的比率和病毒颗粒组成。M蛋白决定囊膜蛋白在极化的上皮细胞表面的分布。通过研究还发现，野生型CDV重组体的毒力比疫苗株的还要低，证明M蛋白对于CDV的毒力很重要（Dietzeletal.,2011）。麻疹病毒属M基因3’UTR比其他UTR都要长，相当于其他UTR的5倍（Heideretal.,1997）。Anderson和VonMessling构建了三个重组病毒：58utrMF-NP，用N基因和P基因之间的UTR替换了M和F之间的UTR；58ᇞF106，将F基因信号肽前106个碱基删除，并在107位加上一个起始密码子，保证F蛋白正确编码；58utrMFNPᇞF106，同时包含前面两种修饰，通过对这三种重组病毒研究，证明M和F之间的UTR调控病毒的复制以及合胞体的形成（Andersonetal.,2008）。1.2.4融合蛋白（F蛋白）CDV的F基因编码662个氨基酸残基，包含信号肽（1～135氨基酸残基）、F1（225～662氨基酸残基）和F2（136～224氨基酸残基）。F蛋白起着介导病毒与宿主细胞相互融合的作用。在F基因的三部份中F蛋白信号肽区（Fsp）的变异率最高，F1基因其次，F2基因最为保守。研究表明，Fsp基因变异性较高，野毒株与疫苗株的差异率为43.0%～49.0%（VonMesslingetal.,2002;Leeetal.,2010），可见F蛋白信号肽区氨基酸的差异率较高。Nicolás等（2013）采用Fsp序列系统发育分析和似然图谱（likelihoodmapping）分析两种方法比较了同一CDV毒株的Fsp编码区序列和H基因序列，结果表明Fsp基因同样适用于CDV基因系统进化研究和CDV毒株基因型的鉴别。应用该方法Nicolás等（2014）分析了乌拉圭、巴西和尼瓜多尔地区毒株Fsp编码区的遗传变异性，结果显示乌拉圭和巴西毒株属于SouthAmerica基因型（EU1/SA1），尼瓜多尔毒株位于一个新分支，命名为SouthAmerica3基因型。由于Fsp编码区长405bp，与H基因编码区相比较短，容易进行扩增、克隆和测序，是构建系统发育树和鉴定CDV毒株基因型的有力工具5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言（Saruteetal.,2013）。F蛋白信号肽的1～75位残基为强亲水区，76～95位残基为低亲水区，96～115位为强亲水区，116～135位为疏水区（VonMesslingetal.,2002）。Fsp蛋白在F蛋白调节CDV与宿主的融合以及维持CDV的持续感染等方面起着尤为重要的作用。VonMessing等（2002）对含有信号肽的F蛋白和缩短氨基端信号序列的F蛋白进行功能对比，发现含有信号肽的F蛋白更稳定，并且活性更低，证明F蛋白信号肽具有调节CDVF蛋白的功能。Plattet等（2007）将Onderstepoort疫苗株F蛋白信号肽与CDVA75/17株F蛋白信号肽进行替换，或者用外源信号肽替换F蛋白信号肽，发现F蛋白信号肽控制F蛋白在细胞内外的表达，从而间接调控F蛋白融合活性。他们还证实F蛋白L372W可以使融合活性低的病毒产生合胞体，表明该位点突变增强了F蛋白融合活性并最终影响CDV的毒力和持续性感染宿主的能力（Plattetetal.,2007）。1.2.5血凝蛋白（H蛋白）H基因由1944～1946个核苷酸组成，含有一个开放阅读框（ORF）。CDVOnderstpoort株H基因的ORF为1815nt，其它毒株多为1824nt。进行序列比对可知，Onderstpoort株ORF的第1814位为A，构成终止密码子TAA，编码604个氨基酸残基，分子量为76～78KDa，而其它毒株ORF的第1814位为C，构成密码子TCA，在1822～1824位构成终止密码子，从而编码607个氨基酸残基，分子量为84KDa（Iwatsukietal.,1997）。H基因为CDV基因组中变异率最高的基因（Blixenkrone-Moelleretal.,1993），是进行CDV野毒株分子流行病学调查的主要靶基因（Cottrelletal.,2013）。根据H基因序列和CDV在世界各地的分布，可将全世界的CDV划分为Asia-1、Asia-2、Europe、Europeanwildlife、America-1、America-2和Arctic7个基因型（Benetkaetal.,2011;Chaetal.,2012;Martellaetal.,2006）。近年来随着犬瘟热在不同地区的流行，犬瘟热的发病区域在不断的扩大，有报道称CDV的基因型又增加了Africa型和Asia-3型（Lanetal.,2005;Lednickyetal.,2004;Martellaetal.,2006）。中国流行的CDV基因型主要是Asia-1型（Zhaoetal.,2010;闫如勋等，2012；朱春生等，2014；刘刚等，2008；Guoetal.,2013），也有报道称在中国出现了Arctic基因型和Asia-3型（Zhaoetal.,2010），可见随着不同地区间的不断引种和世界范围内经济交流的加大，CDV已冲出了其发源地区，开始向其他地区蔓延。H蛋白的跨膜区位于N端38位～58位，共包括21个氨基酸残基，是H蛋白跨膜的信号区和锚定区。H蛋白能够识别并结合宿主细胞受体，是CDV侵入宿主的第一步，之后辅助F蛋白融合宿主细胞，从而进入宿主体内。当CDV侵入宿主体内后，H蛋白能够诱导机体产生中和抗体，对CDV具有很强的中和作用（Hirayamaetal.,1991），同时H蛋白上含有细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位能够激活CTL（Hiramaetal.,2003），CTL对免疫系统清除和抵御麻疹病毒属病毒起着重要的作用（Beauvergeretal.,1996）。不同CDV毒株H蛋白的氨基酸序列变异程度可达10%（VonMesslingetal.,2001），这种差异也表现在抗原性上，因此可以用单克隆抗体区分野毒株和疫苗株的H蛋白，从而鉴别CDV强弱毒株（Hamburgeretal.,1991）。有学者依据H基因建立了逆转录环介导等温扩增法，用于鉴别CDV的疫苗株和野毒株（Liuetal.,2015）。H蛋白起着识别并结合受体的功能，H蛋白上某些氨基酸的改变可能导致H与受体结合能力6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言的改变，可能与CDV宿主范围不断扩大有关。Zipperle等（2010）研究表明，CDV强毒株A75/17H蛋白的Y525，D526和R529控制H蛋白与SLAM受体结合的活性，但不能完全调控H蛋白在膜上的表达。Seki等（2003）研究表明，H蛋白530位由谷氨酸变为赖氨酸，是病毒适应猿猴SLAM受体所必须的。体外实验证明，H蛋白的530位和548位氨基酸决定着CDV对宿主细胞的侵染性（Vongpunsawadetal.,2004;VonMesslingetal.,2005）。对犬敏感的5804株经过在雪貂上传代培养，最终得到适应雪貂的5804P株，该毒株H基因的106位由R变为Q，549位由Y变为H（VonMesslingetal.,2003）。McCarthy等（2007）通过大量的系统发育和分子进化分析，发现非犬源宿主的CDV的H蛋白与SLAM受体结合区，在530位和549位发生了改变，549位变为H，并推测这两个位点的改变导致犬瘟热在非犬源动物内发生。Nikolin等（2012）发现野生犬和家犬易被H蛋白549位为Y的毒株感染，而非犬源的宿主对549位为Y或H的毒株没有显著的嗜性，但是有倾向549位为H的毒株的趋势。接着他们又将犬源CDVH蛋白549位的Y突变成H，发现该毒株在表达其他宿主SLAM基因的细胞中病毒滴度升高，可见549位变为H有助于CDV与其他宿主受体结合（Nikolinetal.,2012）。近年来，通过H基因的测序分析，发现许多地方非犬源动物感染的CDV毒株的H蛋白549位都出现了H（Sekulinetal.,2011;Zhaoetal.,2014;Techangamsuwanetal.,2014），可见549H可能与CDV跨宿主传播有关。CDV野毒株和疫苗株H蛋白糖基化程度不同，可能导致病毒的抗原性不同（Iwatsukietal.,1997）。乙型脑炎病毒（JEV）prM蛋白上15位N-糖基化位点的缺失，可以使病毒的毒力减弱（Kimetal.,2008）。麻疹病毒的N-糖基化位点对H蛋白的抗原性影响很大（Huetal.,1994）。Sawatsky和VonMessling通过对CDVH蛋白的N-糖基化位点进行突变缺失，发现N-糖基化位点缺失后CDV丧失毒力（Sawatskyetal.,2010），可见N-糖基化位点数目的改变可以导致CDV毒力和致病力的改变。对H蛋白上潜在的N-糖基化位点研究发现，疫苗株为4个或7个（Curranetal.,1991;Kövameesetal.,1991），野毒株为8个或9个（Harderetal.，1996），其中309～311位的N-糖基化位点是野毒株特有的。近来中国又发现几株野毒株，其H蛋白在542～544位增加了1个潜在的N-糖基化位点，潜在的糖基化位点数增加到10个，这可能与该地区免疫失败有关（Zhaoetal.,2014）。1.2.6大蛋白（L蛋白）L基因是CDV基因组中最长的基因，其开放阅读框编码2161个氨基酸残基。CDV的L蛋白为其各蛋白中最大的，有聚合酶的活性，由异常的亮氨酸残基和异亮氨酸残基存在的不连续线性且保守的功能区发挥功能。L蛋白是一类多功能的酶单位，与转录和翻译有关，参与mRNA的转录过程，并在mRNA的5’末端加上帽子结构和3’末端形成多聚A尾巴等过程中起着重要的作用（Sidhuetal.,1993）。1.3犬瘟热病毒分离方法1.3.1原代细胞可以使用原代细胞进行CDV的分离培养，常用的原代细胞有犬或貂的肺巨噬细胞、胚胎细7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言胞、肾细胞、外周血淋巴细胞以及鸡胚成纤维细胞（CEF）等（鲜思美等，2005），但是由于原代细胞需要及时制备，不能无限传代，因此不利于CDV的分离及培养。有研究表明，CDV在犬淋巴细胞上比在肺巨噬细胞上的的病毒滴度高，表明CDV更易于在犬淋巴细胞上生长（Appeletal.,1992）。也有报道称，在雪貂的腹腔巨噬细胞上分离到了CDV（Whetstoneetal.,1981）。使用鸡胚的绒膜囊分离CDV，往往需要连续多次接毒，才能出现病变，并且病毒的含量较低，因此不适于CDV的大量培养。1.3.2传代细胞目前国内CDV的分离主要采用传代细胞，如非洲绿猴肾细胞（Vero）、犬肾细胞（MDCK）、、猫肾细胞（CRFK）、绒猴B淋巴细胞系（B95a）等，一般认为Vero细胞是分离CDV的首选细胞。在中国，许多实验室都先后使用Vero细胞分离到CDV（田克恭等，1998；刘双翼等，2009），也有实验室使用MDCK细胞成功分离到CDV（Tanetal.,2011）。Lednicky等（2004）使用Vero细胞、MDCK细胞和MV1Lu（水貂肺细胞）用于野毒株的分离，在MDCK细胞上最先检测到病毒，但是没有Vero细胞的病变明显，而在MV1Lu细胞上生长很慢并且没有明显细胞病变，通过F、H和P基因测序分析，表明初次分出的毒株基因没有发生突变。Sultan等（2009）将分离到的CDV在BHK细胞系上传代，证明多数CDV亚洲野毒株都可以在仓鼠细胞上增殖。传代细胞容易培养，并且生长状态稳定，适用于病毒的分离，但是CDV在细胞上传代次数过多，可以使病毒致弱，不利于强毒株的传代培养。1.3.3表达CDV细胞受体的细胞系目前研究较多也较清楚的CDV细胞受体是SLAM受体和nectin-4受体，其中SLAM受体研究最多。SLAM受体主要位于淋巴细胞上，nectin-4主要位于上皮细胞。国外很多实验室建立了稳定表达SLAM受体的Vero细胞系，用于病毒的分离和CDV发病机制的研究（Sekietal.,2003）。Woma等（2009）建立的表达犬SLAM受体的Vero细胞系，在接入样品后孵育24h就可以看到细胞融合病变。自从nectin-4受体鉴定以后，有些实验室也通过瞬时表达或构建稳定表达nectin-4受体的方法，用于CDV的研究（Alvesetal.,2015）。国内也有实验室构建了表达SLAM受体的细胞系，如赵建军等（2012）构建了稳定表达SLAM受体的Vero细胞系，并成功分离到CDV；刘玉秀（2014）构建了表达犬SLAM细胞系，并分离出1株猴源CDV和1株犬源CDV。表达CDV细胞受体的细胞系的建立，解决了CDV分离的难题，但是细胞受体能否稳定表达，也决定着细胞系的应用价值和应用前景。1.4本研究的目的和意义本研究的目的在于，首先对近年来中国主要毛皮动物养殖区的CDV进行分子检测和遗传变异分析，从分子水平解释可能导致CD频发的原因；其次，对当前流行的CDV野毒株进行分离鉴定，并对鉴定后的毒株进行全基因组测序，研究分离毒株各基因的变异特征，并为CDV的发病机制研究以及新的适应于当前流行毒株的疫苗打下基础；最后，使用分离到的野毒株进行动物致病性研究，从而阐明当前暴发CD的发病规律和发病特征，为CD的有效防治提供参考。8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言9 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析摘要：为了解近年来犬瘟热病毒（Caninedistempervirus,CDV）在中国毛皮动物主要养殖区流行情况及遗传变异特征，本研究于2012～2014年从山东、河北、辽宁省收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料，经犬瘟热抗原检测试纸条检测和RT-PCR检测为阳性后，克隆测序了15条F蛋白信号肽区（Fsp）基因序列、10条H基因序列和12条F基因序列。Fsp基因系统发育进化分析结果表明，15株CDV野毒株均属于中国当前流行的Asia-1型。H、Fsp、F2和F1基因的推导氨基酸序列相似性分析显示，H和Fsp基因的推导氨基酸的变异率较高，F1其次，F2变异率最低。H和F基因系统发育进化分析显示，测序的毒株均属于Asia-1型，与疫苗株遗传距离很远。H和F基因的推导氨基酸比对结果显示，大部分毒株的H蛋白出现了I542N和Y549H变异，导致潜在的N-糖基化位点数增加到10个，同时Fsp基因的推导氨基酸序列中有多个氨基酸残基发生改变。对当前流行CDV野毒株Fsp、H和F基因进行测序分析，结果表明中国主要毛皮动物养殖区CD的发生，不是由于CDV疫苗株返祖而使毒力增强所致，可能与H蛋白Y549H变异、潜在的N-糖基化位点数目增加以及Fsp蛋白发生变异有关。关键词：犬瘟热病毒，Fsp基因，H基因，F基因犬瘟热病毒(caninedistempervirus，CDV)为有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridaefamily），麻疹病毒属（Morbillivirusgenus），同属成员还包括麻疹病毒（measlesvirus，MV）、牛瘟病毒（rinderpestvirus，RPV）和小反刍兽疫病毒（peste-des-petitsruminantsvirus，PPRV）等（Diallo,1990）。CDV基因组全长15690nt，包括6个非重叠基因编码区，按3’-5’端顺序依次为N、P、M、F、H和L基因，分别编码衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、附着或血凝蛋白（H）和大蛋白（L）6种结构蛋白。作为病毒囊膜主要成分的H蛋白和F蛋白与病毒侵入细胞有关（VonMesslingetal.,2001;VonMesslingetal.,2002）：H蛋白通过与受体识别与并结合后诱导F蛋白构象发生改变，构象改变的F蛋白介导病毒以囊膜与细胞质膜相融合的方式入侵宿主（Noyceetal.,2013;Otsukietal.,2013）。由CDV感染引起的犬瘟热是一种跨宿主感染、高度接触性传染病，可感染包括犬科、猫科和鼬科等多种肉食动物，引起宿主动物广泛的淋巴细胞损耗和持续的免疫抑制，导致感染动物容易引发机会感染，发病动物死亡率较高（Kauffmanetal.,1982;Carvalhoetal.,2012）。近年来，CDV基因变异和跨宿主感染的现象时有报道（Seimonetal.,2013;diSabatinoetal.,2014）。CDVH蛋白作为病毒的主要保护性抗原蛋白，其编码基因为CDV基因组中变异率最高的基因（Blixenkrone-Molleretal.,1993），是进行CDV野毒株分子流行病学调查的主要靶基因（VonMesslingetal.,2001;Hashimotoetal.,2001）。基于H基因序列的基因分型结果，可将全世界的CDV划分为Asia-1、Asia-2、Europe、Europeanwildlife、America-1、America-2和Arctic等基因型（Benetkaetal.,2011;Chaetal.,2012;Martellaetal.,2006），其中Asia-1为中国CDV流行的主要基因型（朱春生等，2014）。H蛋白氨基酸的改变和潜在的N-糖基化位点数目的改变，与CDV的毒力与致病10 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析性有关（Huetal.,1994;Sawatskyetal.,2010）。CDVF基因编码662个氨基酸，包含信号肽（1~135氨基酸残基）、F1（225~662氨基酸残基）和F2（136~224氨基酸残基）。研究表明，F蛋白信号肽区（Fsp）基因变异性较高，野毒株与疫苗株的差异率为43.0%～49.0%（VonMesslingetal.,2002;Leeetal.,2010）。Nicolás等（2013）研究表明，Fsp基因与H基因一样适用于CDV基因系统进化研究和CDV毒株基因型的鉴别。并且由于Fsp编码区长405bp，与H基因编码区相比较短，容易进行扩增、克隆和测序，是构建系统发育树和鉴定CDV毒株基因型的有力工具。由于F蛋白起着介导细胞融合的作用，Plattet等（2007）证实F蛋白L372W可以使融合活性低的病毒产生合胞体，表明该位点突变增强了F蛋白融合活性并最终影响CDV的毒力和持续性感染宿主的能力。可见，F蛋白的位点突变可以影响CDV毒力和感染力。为了研究中国毛皮动物中当前流行CDV毒株的遗传变异性，本研究首先从临床疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料中克隆CDV的Fsp基因，阐明了近年来中国毛皮动物中流行CDV的基因型，通过对CDV的H和F基因进行测序分析，对各毒株的变异情况进行了分析，以期为中国CD的防控提供参考。2.1材料和方法2.1.1病料和病毒2012～2014年从河北省昌黎，山东省威海、临沂、诸城，辽宁省大连、锦州等地区的不同养殖场收集的疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料，保存于-80℃。CDV强毒株HeBei株、CDV疫苗株CDV3和Onderstepoort株由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室保存。2.1.2试剂PremixExTaq、病毒RNA小量提取试剂盒、反转录随机引物、RNA酶抑制剂、2.5mmol/LdNTP和AMV酶，购自宝生物工程（大连）有限公司。胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，购自AXYGEN公司。Trans2KPlusDNAMarker、DH5α感受态细胞、FastPfuDNA聚合酶和pEASY-Blunt载体，购自北京全式金生物技术有限公司。犬瘟热抗原检测试纸条，购自上海快灵生物科技有限公司。2.1.3引物设计与合成根据GenBank上登录的犬瘟热病毒核苷酸序列，使用PrimerPremier5.0软件设计3对引物，分别用于CDV的鉴定、Fsp基因和F基因的扩增。H基因的扩增引物参考文献（Zhaoetal.,2010），引物序列信息如表2.1所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成。2.1.4病料处理、病毒RNA提取及反转录采用CDV抗原检测试纸条检测疑似CD病料，无菌采取CD阳性动物的肺脏、脾脏和肝脏，分别放入灭菌的研钵中充分研磨，研磨后加入PBS制成10%(w/v)的匀浆，整个过程均在冰上操11 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析作。病毒RNA的提取按照TaKaRa病毒RNA小量提取试剂盒提供的操作步骤进行。用随机引物进行反转录合成cDNA，反应体系为：5×AMVBuffer4μL，2.5mmol/LdNTP4μL，10μmol/L随机引物0.5μL，RNA酶抑制剂0.5μL，10U/μLAMV酶1μL，RNA10μL。反应条件：42℃水浴1.5h。表2.1PCR引物Table2.1PCRprimers引物名称引物序列目的片段长度（bp）用途CDV-NPF5’-CAGAGGATCATAGACGACCCTGA-3’668CDV的鉴定CDV-NPR5’-GGTGCTGTTTCACCCATCTGYTG-3’CDV-FspF5’-TCCAGGACGTAGCAAGCCAACA-3’672CDVFsp基因的CDV-FspR5’-CTGGTGACTGGGYCTAGYCATG-3’扩增CDV-HF5’-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3’1879CDVH基因的扩CDV-HR5’-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3’增CDV-FF5’-TTAGGGTCCAGGACRYAGCAAGC-3’2231CDVF基因的扩CDV-FR5’-TGTTGGACTACCTGAGYCCTAAG-3’增2.1.5疑似犬瘟热样品的RT-PCR检测用CDV-NP引物对试纸条检测为犬瘟热阳性的样品进行PCR检测。PCR反应体系为：PremixExTaq10μL，上下游引物各1μL，cDNA模板3μL，加无菌超纯水至20μL。反应条件：预变性95℃2min，变性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min，35个循环后总延伸72℃5min，4℃10min。反应结束后，取5μLPCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。2.1.6Fsp、H和F基因的RT-PCR扩增用CDV-Fsp、CDV-H和CDV-F三对引物，分别对PCR鉴定为阳性的样品进行目的片段扩增，反应体系为：5×FastPfuBuffer6μL，2.5mmol/LdNTP3μL，下游引物各1μL，FastPfuDNA聚合酶1μL，加无菌超纯水至30μL。反应条件：预变性95℃2min，变性95℃30s，退火52℃～57℃30s，延伸72℃1min～2min30s，35个循环后总延伸72℃5min，4℃10min。反应结束后，取5μLPCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用胶回收试剂盒纯化目的片段，用于下游实验。2.1.7Fsp、H和N基因的克隆和测序将目的片段与pEASY-Blunt载体连接，转入DH5α感受态细胞，用蓝白斑法挑选白色菌落，经PCR鉴定为阳性后，至少选取3个阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。序列确定以后提交GenBank。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析2.1.8序列分析从GenBank中调取世界范围内已登录的CDV毒株的Fsp基因，使用MEGA5.0软件的ClustalW方法进行比对，采用最大似然法（MaximunLikelihood）中的Hasegawa-Kishino-Yano（G）模型构建系统发育进化树，以Bootstrapmethod为检验方法（TestofPhylogeny），重复500次（Saruteetal.,2013）。应用DNAStar软件对测序的H和F基因进行比对分析，并按照Fsp基因方法构建系统发育进化树。应用NetNGlyc1.0Server在线软件分析H和F蛋白潜在的N-糖基化位点。2.2结果2.2.1疑似犬瘟热样品的RT-PCR检测以反转录得到的cDNA为模板，CDV-NP为引物，经PCR扩增后得到大小约为668bp条带，与预期结果相符（图2.1），证明为犬瘟热阳性。图2.1RT-PCR鉴定结果M：DNA分子量标准TransPlus2K；1～6：RT-PCR扩增产物；7：阳性对照；8阴性对照Fig.2.1TheresultsofRT-PCRidentificationM:DNAMarkerTransPlus2K;1～6:RT-PCRproducts;7:Positivecontrol;8:Negativecontrol2.2.2Fsp、H和F基因的扩增以15份CD阳性病料的cDNA为模板，分别用CDV-Fsp、CDV-H和CDV-F三对引物进行RT-PCR扩增，分别得到大小约为672bp、1879bp和2231bp条带，与预期结果相符（图2.2、2.3、2.4）。从病料中选取15份CD阳性病料，全部扩增到Fsp基因，扩增率达到100.0%。从病料中扩增到10条H基因序列和12条F基因序列，其中H基因序列和F基因序列来源于同一份病料的记为同一毒株。13 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析图2.2Fsp基因扩增结果M：DNA分子量标准TransPlus2K；1～5：Fsp基因扩增产物；6：阳性对照；7：阴性对照Fig.2.2TheresultsofFspgenesamplificationM:DNAMarkerTransPlus2K;1～5:TheproductsofFspgenes;6:Positivecontrol;7:Negativecontrol图2.3H基因扩增结果M：DNA分子量标准TransPlus2K；1～6：H基因扩增产物Fig.2.3TheresultsofHgenesamplificationM:DNAMarkerTransPlus2K;1～6:TheproductsofHgenes图2.4F基因扩增结果M：DNA分子量标准TransPlus2K；1～5：F基因扩增产物；6：阳性对照；7：阴性对照Fig.2.4TheresultsofFgenesamplificationM:DNAMarkerTransPlus2K;1～5:TheproductsofFgenes;6:Positivecontrol;7:Negativecontrol14 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析2.2.3CDVFsp基因的遗传进化分析将15株CDV野毒株Fsp基因序列提交GenBank。以15株CDV野毒株Fsp基因序列构建的系统发育进化树，如图2.5所示。结果表明，2012～2014年测序的15株CDV野毒株和GenBankKM873771/mink/SD(13)10/China/2013KM873772/mink/SD(13)11/China/2013KM873763/raccoon_dog/SD(13)1/China/2013KM873762/mink/SD(12)1/China/2012KM873773/mink/SD(14)1/China/201456KM873767/mink/SD(13)6/China/2013KM873781/mink/SD(14)9/China/2014NewbranchKM873776/raccoon_dog/SD(14)4/China/2014KM873779/fox/SD(14)7/China/201495KM873780/fox/SD(14)8/China/2014KM873759/mink/HB(14)1/China/201483KM873761/mink/LN(13)3/China/2013KM979343/mink/HB(14)2/China/2014KM873760/mink/LN(13)2/China/201365KJ848781/raccoon_dog/CDV-RD-JL/China/2014KP064130/fox/SD(08)1/China/200879EF596900/raccoon_dog/GN/ChinaEF596902/raccoon_dog/SC01China/2007AB509344/dog/Th12/ThailandEU192009/TW-KM3EU192010/TW-KM461EU192005/TW-TD2EU192007/TW-KM1EU191999/TW-TN189AB512286/dog/Ac96I/JapanAsia-1AB512286/Ac961/Japan59AB509341/dog/81ND/Japan97AB509345/dog/50Sc/JapanJN896331/dog/PS/China/2010EU327874/fox/HeB(07)1/China/2007KC427278/mink/Hebei/China/200884EU934234/raccoondog/BS0610/China/2006KP064126/raccoon_dog/HeB(07)2/China/2007KC667068/dog/GZ0804/China/201272EU327875/raccoon_dog/JL(07)1/China2007JX681125/fox/HLJ1-06/China/20066753KP064129/raccoon_dog/SD(06)2/China/2006HQ540292/dog/HLJ2-07/China/2007KM979344/fox/LN(14)2/China/201480KP064128/fox/HLJ(08)1/China/2008KJ466106/raccoon_dog/CDV_SY/China/201296KJ994343/raccoon_dog/CDV-ZC/China/2013KP064127/fox/HLJ(07)1/China/200770AB687720/Macaca_fascicularis/CYN07-dV/Japan/2008100HM852904/Macacamulatta/MKY-KM08/China/200863EF596903/fox/NM/China9967JN381189/dog/GZ2/China/2011AB607904/raccon_dog/_W729B/Japan/2007AB619776/Raccoon_dog/_Yamaguchi/RD/091216/Japan/2009AY964110/19876Europewild-lifeAB474397/007Lm98AB476401/011C100Asia-2AB475101/009LAB476402/50ConEF596901/HLKF914669/CDV2784/2013100ArcticAY964108/181338196AY964112/21261KF684026/UY2358992KM280689/Uy25198KC331150/UY102Europe99KF684028/BR151AY386316/5804pEU726268/CDV399100JN896987/Snyder_HillAmerica-1(Vaccine)AF378705/OnderstepoortRockbornAY443350/00-2601AF164967/A75-1764America-2EU716337/1640719977KJ123771/171391-5130.02图2.5基于CDVFsp基因序列的系统发育分析Fig.2.5PhylogeneticanalysisofCDVFspgenesequences15 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析中调取的序列分别位于7个基因型中，15株CDV野毒株属于Asia-1基因型，并与JL株（KJ848781）遗传距离最近。2.2.4H基因序列与遗传进化分析将从病料里克隆到的10株CDV毒株的H基因和推导氨基酸序列，与GenBank上登录的Asia-1型强毒株HeBei株和疫苗株CDV3、Onderstepoort相比，10株CDV野毒株的H基因和推导氨基酸序列之间的相似性分别为97.1%～99.9%和97.0%～99.8%，与疫苗株CDV3和Onderstepoort的相似性分别为90.6%～91.0%和90.6%～91.1%，与Asia-1型强毒株HeBei株的相似性分别为97.3%～98.8%和97.3%～98.8%，如表2.2所示。从H基因的系统发育树上可以看出，10株CDV野毒株属于Asia-1型，与Asia-1型强毒株HeBei株分别位于不同的遗传分枝，遗传关系较远，如图2.6所示。表2.2H基因的核苷酸序列与氨基酸序列的相似性Table2.2TheidentityoftheHgenenucleicacidandaminoacidsequences毒株LN(13)2HB(14)1HB(14)2LN(14)1LN(14)2SD(14)5SD(14)6SD(14)7SD(14)9SD(14)10HebeiCDV3OnderStrainLN(13)299.199.196.896.998.898.599.098.899.097.590.690.7HB(14)199.199.897.197.299.399.099.599.299.497.990.791.0HB(14)299.199.897.197.299.399.099.599.299.497.990.790.9LN(14)196.897.197.199.996.996.597.096.897.098.790.991.0LN(14)296.997.297.299.996.996.697.196.997.098.891.091.1SD(14)598.899.399.396.996.999.199.699.499.697.690.690.7SD(14)698.599.099.096.596.699.199.399.199.297.390.590.6SD(14)799.099.599.597.097.199.699.399.699.797.890.790.9SD(14)998.899.299.296.896.999.499.199.699.797.590.690.7SD(14)1099.099.499.497.09799.699.299.799.797.790.890.9Hebei97.597.997.998.798.897.697.397.897.597.791.491.6CDV390.690.790.790.991.090.690.590.790.690.891.497.2Onder90.791.090.991.091.190.790.690.990.790.991.697.2注：左下侧为氨基酸的相似性，右上侧为核苷酸的相似性。Onder:OnderstepoortNote:Theupper-rightfornucleotidesequencesidentityandthelower-leftforaminoacidsequencesidentity.Onder:Onderstepoort16 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析84mink/SD(14)9/China/2014mink/SD(14)10/China/201494mink/SD(14)5/China/2014KP765763/fox/SD(14)7/China/201464mink/SD(14)6/China/2014KF880682/mink/SD(13)5/China/201366KF880678/raccoondog/SD(13)1/China/201394KF880680/fox/SD(13)3/China/2013542N-Glycanstrainsfox/HB(14)2/China/20146694mink/HB(14)1/China/2014KC494688/mink/SD(12)3/China/2012100JX844220/mink/SD(12)1/China/2012KF880677/mink/LN(13)2/China/20134898KJ579444/fox/WD(13)11/China//20131553KJ994343/raccoondog/ZC/China/2013KJ848781/racoondog/JL/201463FJ810214/raccoondog/JL(08)2/China/200899FJ810215/fox/SD(08)1/China/2008HM448830/raccoondog/HeB(09)1/China/200999KF006819/raccoondog/LN(13)1/20133894KF006820/mink/HeB(13)1/2013Asia-1JN896331/dog/PS/China/2010KJ489383/dog/NJ(12)7/China/201245EF042818/raccoondog/SC01/China50HQ540292/dog/HLJ2-07/China/20078581EU325720/fox/HeB(07)1/China/20078787KC427278/mink/Hebei/China/200891EU379560/mink/SD(07)1/China/2007JX681125/fox/HLJ1-06/China/20064890FJ423609/fox/LN(08)1/China/200826KJ466106/raccoondog/SY/China/201266FJ423605/fox/HLJ(08)2/China/20087288KF767692/fox/HLJ(13)1/China/201391fox/LN(14)1/China/2014100fox/LN(14)2/China/2014100AB753775/dog/Ac96I/JapanDQ922630/fox/MS01/ChinaEF445053/NM/ChinaHM852904/MKY-KM08/China/20086199AB687720/Macacafascicularis/CYN07/dV/Japan/2008100AB687721/Macacafascicularis/CYN07-hV/Japan/200899KF856711/monkey/BJ-01/China/200671AY386315/5804Europe64AF164967/A75/17America-292KF640687/dog/R252/USAEuropewild-lifeAB474397/dog/007Lm/JapanAsia-2Z47760/dog/GR88/GreenlandArcticAF378705/OnderstepoortAmerica-1(vaccine）0.01图2.6基于CDVH基因序列的系统发育分析Fig.2.6PhylogeneticanalysisofCDVHgenesequences17 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析2.2.5H氨基酸序列分析使用DNAStar软件中的MegAlign程序，将10株CVD野毒株的H氨基酸序列与Asia-1型强毒株HeBei和疫苗株CDV3、Onderstepoort进行比对分析。结果表明，LN(13)2、HB(14)1、HB(14)2、SD(14)5、SD(14)6、SD(14)7、SD(14)9、SD(14)10发生Y542H的变异，而LN(14)1和LN(14)2与HeBei株的542位相同都为Y，10株野毒株的530位与HeBei株相同为G，如图2.7所示。应用NetNGlyc1.0Server在线软件对H蛋白上潜在N-糖基化位点进行分析，结果显示，图2.7不同CDV毒株H基因的氨基酸序列比对；Onder：OnderstepoortFig.2.7alignmentoftheHaminoacidsequencesofdifferentCDVstains;Onder:Onderstepoort18 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析LN(13)2、HB(14)1、HB(14)2、SD(14)5、SD(14)6、SD(14)7、SD(14)9、SD(14)10比HeBei多1个潜在的N-糖基化位点，潜在的N-糖基化位点个数增加到了10个，LN(14)1和LN(14)2与HeBei相同为9个，疫苗株CDV3为7个，而Onderstepoort为6个，如图2.7所示。2.2.6F基因序列与遗传进化分析将F基因分为3段，即Fsp基因、F2基因和F1基因，以各基因的氨基酸序列与疫苗株CDV3和Onderstepoort及Asia-1型强毒株HeBei株进行比对分析，可以看出12株CDV野毒株Fsp基因的推导氨基酸序列的相似性为93.1%～100%，与疫苗株CDV3和Onderstepoort的相似性为80.5%～81.7%，与Asia-1强毒株HeBei株的相似性为95.7%～97.0%，如表2.3所示。12株野毒株F1基因的推导氨基酸序列的相似性为98.2%～99.8%，与疫苗株CDV3和Onderstepoort的相似性为95.7%～96.6%，与Asia-1强毒株HeBei株的相似性为98.4%～99.1%，如表2.4所示。12株野毒株F2基因的推导氨基酸序列的相似性为97.8%～100.0%，与疫苗株CDV3和Onderstepoort的相似性为94.4%～97.8%，与Asia-1强毒株HeBei株的相似性为97.8%～100.0%，如表2.5所示。表2.3Fsp氨基酸序列的相似性Table2.3TheidentityoftheFspaminoacidsequences毒株123456789101112131415Strains199.599.894.394.399.598.899.098.599.599.399.396.381.781.520.599.894.194.199.598.899.098.599.599.399.396.081.581.230.20.294.394.399.899.099.398.899.899.599.596.381.781.546.06.36.0100.094.193.393.693.194.193.893.897.081.080.756.06.36.00.094.193.393.693.194.193.893.897.081.080.760.50.50.26.36.399.399.59910099.899.896.081.581.571.21.21.07.17.10.798.898.399.399.099.095.381.081.581.01.00.76.86.80.51.298.599.599.399.395.681.08191.51.51.27.47.41.01.71.599.098.898.895.180.580.5100.50.50.26.36.30.00.70.5199.899.89681.581.5110.70.70.56.56.50.21.00.71.20.210095.881.281.2120.70.70.56.56.50.21.00.71.20.20.095.881.281.2133.84.13.83.13.14.14.94.65.24.14.44.483.082.71421.421.721.422.522.521.722.422.423.121.722.122.119.795.31521.722.121.722.822.821.721.622.423.121.722.122.120.04.9注：1～15:LN(13)2、HB(14)1、HB(14)2、LN(14)1、LN(14)2、SD(14)1、SD(14)3、SD(14)5、SD(14)7、SD(14)8、SD(14)9、SD(14)10、Hebei、CDV3、Onderstepoort19 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析表2.4F1氨基酸序列的相似性Table2.4TheidentityoftheF1aminoacidsequences毒株123456789101112131415Strains199.599.198.999.198.698.698.498.498.998.998.998.996.496.120.299.399.199.398.998.998.698.699.199.199.199.196.696.430.70.598.698.998.498.498.298.298.698.698.698.696.195.940.90.71.299.598.698.698.498.498.998.998.998.996.496.450.70.50.90.298.998.998.698.699.199.199.199.196.696.461.20.91.41.20.999.399.199.199.599.599.598.696.195.971.20.91.41.20.90.599.199.199.599.599.598.696.696.481.41.21.61.41.20.70.798.999.399.399.398.495.995.791.41.21.61.41.20.70.70.999.399.399.398.495.995.7100.90.71.20.90.70.20.20.50.599.899.898.996.496.1110.90.71.20.90.70.20.20.50.50.099.898.996.496.1120.90.71.20.90.70.20.20.50.50098.996.496.1130.90.71.20.90.71.21.21.41.40.90.90.996.496.1143.53.33.73.53.33.73.3443.53.53.53.598.4153.73.543.53.543.54.24.23.73.73.73.71.4注：1～15:LN(13)2、HB(14)1、HB(14)2、LN(14)1、LN(14)2、SD(14)1、SD(14)3、SD(14)5、SD(14)7、SD(14)8、SD(14)9、SD(14)10、Hebei、CDV3、Onderstepoort表2.5F2氨基酸序列的相似性Table2.5TheidentityoftheF2aminoacidsequences毒株123456789101112131415Strains100.0100.098.998.9100.0100.098.9100.0100.0100.0100.098.994.496.610.0100.098.998.9100.0100.098.9100.0100.0100.0100.098.994.496.620.00.098.998.9100.0100.098.9100.0100.0100.0100.098.994.496.631.11.11.110098.998.997.898.998.998.998.9100.095.597.841.11.11.10.098.998.997.898.998.998.998.9100.095.597.850.00.00.01.11.1100.098.9100.0100.0100.0100.098.994.496.660.00.00.01.11.10.098.9100.0100.0100.0100.098.994.496.671.11.11.12.32.31.11.198.998.998.998.997.893.395.580.00.00.01.11.10.00.01.110010010098.994.496.690.00.00.01.11.10.00.01.10.010010098.994.496.6100.00.00.01.11.10.00.01.10.00.010098.994.496.6110.00.00.01.11.10.00.01.10.00.00.098.994.496.6121.11.11.10.00.01.11.12.31.11.11.11.195.597.8135.85.85.84.64.65.85.87.15.85.85.85.84.697.8143.53.53.52.32.33.53.54.63.53.53.53.52.32.315注：1～15:LN(13)2、HB(14)1、HB(14)2、LN(14)1、LN(14)2、SD(14)1、SD(14)3、SD(14)5、SD(14)7、SD(14)8、SD(14)9、SD(14)10、Hebei、CDV3、Onderstepoort20 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析使用12株CDV野毒株与从GenBank上调取的其他毒株的F基因全长构建系统发育进化树，结果表明，各毒株分别位于7个基因型中，12株CDV野毒株属于Asia-1型，并与Asia-1型强毒株HeBei株位于不同的遗传分枝，遗传关系较远。LN(14)1和LN(14)2株与HLJ(08)1株（KP064128）的遗传关系最近，其余10株与JL株（KJ848781）的遗传关系最近，如图2.8所示。98mink/SD(14)9/China/201465mink/SD(14)10/China/2014fox/SD(14)8/China/201459KP765763/fox/SD(14)7/China/2014mink/SD(14)1/China/201499mink/SD(14)5/China/2014100mink/SD(14)3/China/2014mink/LN(13)2/China/20136557mink/HB(14)1/China/201463fox/HB(14)2/China/201469KJ848781/racoondog/JL/China/2014EF042818/raccoondog/SC01/ChinaEF596900/raccoondog/GN/China5251FJ810215/fox/SD(08)1/China/2008100KP064130/fox/SD(08)1/China/2008JN896331/dog/PS/China/2010AB753775/dog/Ac96I/JapanEU191999/TW-TN199EU192005/TW-TD27057EU192010/TW-KM49862EU192007/TW-KM1Asia-163EU192009/TW-KM3KJ994343/raccoondog/ZC/China/2013KJ466106/raccoondog/SY/China/201295JX681125/fox/HLJ1-06/China/2006KP064129/raccoondog/SD(06)2/China/200678KP064126/raccoondog/HeB(07)2/China/20077283KC427278/mink/Hebei/China/200882EU327874/fox/HeB(07)1/China/2007EU934234/raccondog/BS0610/China/2006KC667068/dog/GZ0804/China/2012HQ540292/dog/HLJ2-07/China/2007100KP064128/fox/HLJ(08)1/China/200874fox/LN(14)1/China/2014100fox/LN(14)2/China/2014KP064127/fox/HLJ(07)1/China/2007EF445053/fox/NM/ChinaHM852904/MKY-KM08/China/200878KF856711/monkey/BJ-01/China/2006100AB687720/Macacafascicularis/CYN07-dV/Japan/200872AB687721/Macacafascicularis/CYN07-hV/Japan/2008AY386315/5804EuropeAF164967/A75/17America-2KF640687/dog/R252/USAEuropewild-life83AB474397/dog/007Lm/JapanAsia-25796KF914669/dog/2784/Italy/2013Arctic64AF378705/OnderstepoortAmerica-10.005图2.8基于CDVF基因序列的系统发育分析Fig.2.8phylogeneticanalysisofCDVFgenesequences21 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析2.2.7F氨基酸序列分析使用DNAStar软件中的MegAlign程序，将12株CVD野毒株的F氨基酸序列与Asia-1型强毒株HeBei和疫苗株CDV3、Onderstepoort进行比对分析。结果显示，12株CVD野毒株与3株参考毒株相比，F蛋白的Fsp氨基酸序列变异率较高，F1氨基酸序列略有变异，而F2氨基酸序列变异率较低，其中Fsp氨基酸序列的3～116位之间变异率最高；除SD(14)3外其余11个毒株都含有6个潜在的N-糖基化位点，SD(14)3的62位变为D，而缺少一个N-糖基化位点，疫苗株Onderstepoort62位为P，也不能生成N-X-T/S这种糖基化位点序列，而包含5个潜在的N-糖基化位点；SD株的F蛋白全部出现Q303K和T481S的突变，如图2.9所示。图2.9不同CDV毒株F基因的氨基酸序列比对；Onder：OnderstepoortFig.2.9alignmentoftheFaminoacidsequencesofdifferentCDVstains;Onder:Onderstepoort22 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析2.3讨论CDV分子流行病学研究主要依据CDVH基因对CDV进行分型及遗传分析(Benetkaetal.,2011;Budaszewskietal.,2014），但是H基因编码区较长，不易于从病毒含量较低的组织病料中得到扩增。Nicolás等（2013）证明了F基因的信号肽编码区序列（Fsp）可以同H基因一样用于CDV的基因分型和遗传分析，并且Fsp基因序列较短，容易进行扩增、测序和分析。本研究从15份CD阳性病料中扩增到Fsp基因序列，扩增阳性率为100.0%，对15株野毒株的Fsp基因序列进行测序分析，表明Fsp基因确实容易进行扩增、测序和分析，在快速鉴定野毒株基因型方面与H基因相比具有一定优势。基于Fsp基因序列构建的系统发育进化树显示，15株野毒株均属于Asia-1型，与疫苗株的遗传距离较远，两者分别位于两个不同的遗传分枝上（图2.5），与报道的对CDV-H基因分型结果一致(闫如勋等，2012；朱春生等，2014)。从系统发育树上可以看出，LN(14)2株与HLJ2-07位于同一分枝上，而其余14株毒株位于一个新的分枝上，并且与LN(14)2株距离较远，表明中国毛皮动物中流行的CDV毒株间存在差异。近来对于该地区毛皮动物中流行的CDV毒株SD(12)1、LN(13)2、SD(13)1、SD(13)3和SD(13)6等的H蛋白序列分析表明，H蛋白的542位突变为N，549位突变为H，该变异株引起当地暴发了犬瘟热，发病动物死亡率较高（Zhaoetal.,2014）。本研究对以上部分毒株的Fsp序列进行了分析，发现这些变异株的Fsp基因也归于Asia-1基因型内一个新的遗传分枝，与之前研究结果相同（Zhaoetal.,2014）。测序的15株野毒株与本实验室保存的CDV强毒株HeBei株位于不同的分枝上，并且遗传距离较远，表明15株野毒株与CDV强毒株HeBei株之间存在较大的差异。为了阐明中国毛皮动物中当前流行CDV毒株的遗传变异性，本研究从病料中扩增了CDV野毒株的H基因全长和F基因全长，部分毒株同时扩增到了此两种基因，有些毒株仅扩增到其中1个。VonMessling等（2002）研究表明，野毒株与疫苗株Fsp蛋白氨基酸差异率达到27.5%。Lee等（2010）研究发现野毒株与疫苗株的差异率为43.0%～49.0%，可见Fsp蛋白氨基酸的变异率较高。从H、Fsp、F1和F2的氨基酸序列比对结果可以看出，10株野毒株间H基因的氨基酸序列的相似性为97.0%～99.8%；12株野毒株F基因的Fsp基因片段和F2基因片段的推导氨基酸序列的相似性的差异较大分，别为93.1%～100%和97.8%～100.0%；F1基因片段的推导氨基酸的相似性为98.2%～99.8%。与疫苗株CDV3和Onderstepoort相比，10株野毒株间H基因的推导氨基酸序列的相似性为90.6%～91.1%，12株野毒株Fsp基因片段、F2基因片段以及F1基因片段的推导氨基酸序列的相似性分别为80.5%～81.7%、94.4%～97.8%和95.7%～96.6%，而与Asia-1强毒株HeBei株相比，10株野毒株H基因的推导氨基酸序列的相似为97.3%～98.8%，12株野毒株Fsp基因片段、F2基因片段以及F1基因片段的推导氨基酸序列的相似性分别为95.7%～97.0%、97.8%～100.0%和98.4%～99.1%。H基因变异率较高，F基因中Fsp基因片段的变异率最高，F1基因片段其次，F2基因片段变异率最低，与之前研究结果相同（Leeetal.,2010）。CD的预防主要是依靠疫苗免疫，但是由于免疫失败或毒株变异，往往会给CD的有效防治带来很大障碍。1995年，在用多价苗免疫过的犬中也出现脑炎的疑似病例，并且此多价苗中含有CDVRockborn疫苗株（Martellaetal.,2010）。Ek-Kommonen等（2003）报道从外地引入的欧洲貂，在免疫接种改良的活病毒疫苗预防CD时，接种30d后公貂发病死亡，通过序列比对发现，23 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析从死貂组织中克隆的CDV基因序列与疫苗株的相似性达到100%，证明此次发病是由于疫苗株引起的，该报道也首次利用分子生物学方法证实疫苗免疫可以导致CD的发生。中国流行的CDV野毒株主要是Asia-1型，也有报道称有Arctic和Asia-3型存在（Zhaoetal.,2010）。通过使用H基因和F基因构建进化树可以看出，本研究中测序的CDV毒株都为Asia-1型，没有出现其他基因型，与疫苗株在不同基因型中，遗传距离很远，表明当前CDV的流行不是由于疫苗株返祖而使毒力返强造成的。McCarthy等（2007）通过大量的系统发育和分子进化分析，发现非犬源宿主的CDV的H蛋白与SLAM受体结合区，在530位和549位与犬源CDVH蛋白相比发生了改变，其中549位变为H，并推测这两个位点的改变导致CD在非犬源动物中发生。VonMessling等（2003）研究显示，对犬敏感的CDV5804株经过雪貂传代，最终得到适应雪貂的5804P株，该毒株H基因的106位由R变为Q，549位由Y变为H。可见，H蛋白549位由Y变为H可能与CDV感染非犬源肉食动物有关。本研究发现，10株野毒株的H基因的530位与参考序列相同都为G，而549位除LN(14)1和LN(14)2与HeBei株相同为Y以外，其他8个毒株都发生Y549H的变异。近年来，通过H基因的测序分析，发现许多地区感染非犬源动物的CDV毒株的H蛋白都出现了Y549H变异（Sekulinetal.,2011;Zhaoetal.,2014;Techangamsuwanetal.,2014），可见549H可能使CDV对水貂、狐狸和貉的适应性增强，从而导致毛皮动物中CD发病率增高。乙型脑炎病毒（JEV）prM蛋白第15位潜在的N-糖基化位点缺失，可以使病毒的毒力减弱（Kimetal.,2008）。麻疹病毒的潜在的N-糖基化位点对H蛋白的抗原性影响很大（Huetal.,1994）。Sawatsky和VonMessling（2010）通过对CDVH蛋白的潜在的N-糖基化位点进行突变缺失，发现潜在的N-糖基化位点缺失后CDV丧失毒力。除了LN(14)1和LN(14)2外，其他8个CDV野毒株的H蛋白都出现I542N突变，从而在542～544位增加了1个潜在的N-糖基化位点，潜在的N-糖基化位点数增加到10个，这可能使CDV的毒力增强，造成免疫失败，导致动物的发病率增加（Zhaoetal.,2014）。从H基因系统发育树上可以看出，所有出现I542N突变的Asia-1毒株，在Asia-1基因簇中归于同一个新的遗传分枝（图6），与之前研究结果相同（Zhaoetal.,2014）。从出现I542N和Y549H变异的毒株地理分布来看，在中国山东省的临沂市、诸城市、威海市，辽宁省的大连市，河北省的昌黎县等地区已经出现了该变异毒株的流行，而辽宁省的锦州市还没发现此变异株，在中国其他毛皮动物主要养殖区内是否出现该变异，还需要从不同地区采集大量样本进行测序分析。从F蛋白的氨基酸比对结果来看，F蛋白中变化最大的是Fsp蛋白，F1其次，F2最保守（图2.9）。VonMessing等（2001）比较了含有信号肽的F蛋白和缩短氨基端信号序列的F蛋白的功能，发现含有信号肽的F蛋白更稳定，并且活性低，证明F蛋白信号肽具有调节CDVF蛋白的功能。Plattet等（2007）将疫苗株Onderstepoort的F蛋白信号肽与CDVA75/17株F蛋白信号肽进行替换，或用外源信号肽替换F蛋白信号肽，研究表明F蛋白信号肽控制F蛋白在细胞内外的表达，从而间接调控F蛋白融合活性。F蛋白中某些氨基酸的突变可以改变F蛋白融合活性，并最终影响CDV的毒力和持续性感染宿主的能力（Plattetetal.,2007）。本研究中Fsp蛋白氨基酸序列在多个位点出现了连续改变，与王凤雪等之前研究结果一致（王凤雪等，2008）。这些位点的改变可能改变该位点氨基酸的极性，然而这种改变是否影响F蛋白的成熟或改变成熟蛋白的融合活性，进而改变CDV野毒株的毒力和持久感染力等，有待进一步研究。潜在的N-糖基化位点分析结果显示，除SD(14)3外其余11个毒株都含有6个潜在的N-糖基化位点，SD(14)3的62位变为D，24 中国农业科学院硕士学位论文第二章水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒Fsp、H和F基因的克隆与序列分析而缺少一个潜在的N-糖基化位点，疫苗株Onderstepoort的62位为P，也不能生成N-X-T/S这种糖基化位点序列，从而包含5个潜在的N-糖基化位点。H基因含有10个潜在N-糖基化位点的毒株，其F蛋白潜在的N-糖基化位点数大都与Asia-1型强毒株HeBei株相同，没有出现明显变化。本研究表明，Fsp基因的系统发育分析结果与H基因和F基因的分析结果相似，适用于CDV野毒株的快速分型，可用于CDV分子流行病学调查。近年来中国毛皮动物主要养殖区流行的CDV毒株与疫苗株相比存在较大的差异，可见CD的流行不是由于疫苗毒株毒力返强造成的，H蛋白出现I542N和Y549H变异，以及Fsp基因发生很大变异，可能与中国毛皮动物养殖区CD流行并维持高的感染率和死亡率有关，这将为毛皮动物CD的防控提供参考依据。25 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析摘要：采用Vero-SLAM细胞从山东省荣成市某养殖场疑似CDV感染狐狸的肺脏样品中分离得到1株病毒，经RT-PCR、病毒形态观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验等鉴定后，证明为CDV，命名为SD(14)7。采用RT-PCR对SD(14)7株的全基因组进行分段扩增，经克隆测序后拼接成SD(14)7全基因组序列，并对其全基因组和H基因进行分析。结果表明，SD(14)7株的全基因组序列长15690nt，与LN(10)1株的相似性最高为98.8%，与疫苗株CDV3、Onderstepoort和SnyderHill之间的相似性较低为91.9%～92.2%。对SD(14)7株的全基因组和H基因进行系统发育树分析，结果表明该毒株属于Asia-1，为中国当前流行的CDV野毒株。通过对H蛋白序列进行分析，发现SD(14)7株H蛋白发生了I542N和Y549H突变，在542～544位增加了1个潜在的N-糖基化位点，N-糖基化位点总数增加到了10个。该变异株的成功分离鉴定及全基因组序列测定，为探讨当前中国主要毛皮动物养殖区CDV流行的原因及CD的有效防治打下了基础。关键词：犬瘟热病毒，分离，鉴定，全基因组序列犬瘟热（Caninedistemper,CD）是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。犬瘟热在全世界范围内分布，虽然使用有效的疫苗进行防控，但是还维持着高感染率和高死亡率，给中国毛皮动物养殖业带来了巨大损失。近年来中国主要毛皮动物养殖区时常暴发CD，已有研究证明当前CDV流行毒株的H基因发生I542N和Y549H突变，于542～544位增加了1个潜在的N-糖基化位点，该变异可能与犬瘟热的免疫失败和大范围流行有关（朱春生等，2014；Zhaoetal.,2014）。本研究于2014年7月从山东省某地区的狐狸养殖场采集的CD阳性病料中成功分离到1株病毒，经RT-PCR，病毒形态观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验等鉴定后，证明分离毒株为CDV野毒株，命名为SD(14)7，并对其全基因组进行了测序和分析。该变异野毒株的成功分离与全基因组的测序分析，为我们阐明该地区CD的流行原因，以及CD的有效防治打下了基础。3.1材料与方法3.1.1细胞、毒株及实验动物Vero-SLAM细胞及CDV疫苗株CDV3（EU726268）和CDV强毒株HeBei株（KC427278），由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室保存；试验用水貂和狐狸由中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地提供。3.1.2主要试剂和仪器FITC标记山羊抗小鼠二抗，购自KPL公司；CDV-NP单克隆抗体，购自vmrd公司；。MEM培养基、青链霉素混合液，购自Invitrogen公司；特级胎牛血清，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；QIAampViralRNAMiniKit，购自QIAGEN公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂26 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析盒，购自AXYGEN公司；One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒、0.25%胰蛋白酶、Trans2KPlusDNAMarker、DH5α感受态细胞、FastPfuDNA聚合酶和pEASY-Blunt载体，购自北京全式金生物技术有限公司；CDV抗原检测试纸条，购自上海快灵生物科技有限公司；荧光倒置显微镜，购自Leica；冷冻高速离心机HITACHI，购自日本日立公司；二氧化碳培养箱，购自日本三洋；BSC-1300IIA2型生物安全柜，购自苏州安泰；PCR仪，购自Biometr；电泳仪，购自北京六一；凝胶成像仪，购自GE。3.1.3病毒分离3.1.3.1病料的收集与处理2014年7月从山东省多家养殖场收集疑似CD症状的水貂、狐狸和貉，无菌采集肺、肝、脾、肠系膜淋巴结等组织脏器，放入灭菌的研钵中加入液氮充分研磨，研磨后加入无血清MEM制成10%(w/v)的匀浆，反复冻融3次。10000rpm4℃离心10min后，取上清，加入2000单位双抗，于37℃孵育1h，然后于-80℃保存。3.1.3.2引物设计与合成CDVRT-PCR检测引物的设计与合成参考第二章。根据GenBank上登录的Asia-1型HeBei株的序列，参照本实验室已有引物，设计彼此间相重叠的15对引物，用于CDV的全基因组分段扩增，引物信息见表3.1，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。3.1.3.3CDV阳性样品的筛选使用RT-PCR和CDV抗原检测试纸条对处理后的样品进行检测，筛选出CDV阳性样品用于病毒的分离。3.1.3.4病毒的分离复苏Vero-SLAM细胞，于37℃CO2培养箱中培养，待细胞长满单层时加入胰酶消化细胞，用含2%胎牛血清和400μg/mLG418的MEM培养基悬浮细胞，按1传3进行传代培养，置37℃CO2培养箱中培养24h。然后，吸出培养液，用PBS（pH7.4）洗涤1次，加入处理后的样品，轻轻摇动使样品吸附于细胞表面，置37℃孵育1h，更换新鲜细胞培养基，于细胞培养箱中继续培养，每天观察细胞状态。3～4d后带毒盲传1代，以此类推盲传至6代，细胞仍无变圆融合，拉网，脱落等病变现象的视为阴性；出现病变的细胞，反复冻融3次，5000rpm4℃离心10min后分装小管，于-80℃保存。3.1.3.5RT-PCR鉴定RT-PCR检测CDV的方法和步骤参考第二章。3.1.3.6病毒形态观察取分离得到的病毒上清，使用0.5%的磷钨酸进行负染，于电镜下观察病毒的形态。3.1.3.7间接免疫荧光试验取长成单层的Vero-SLAM细胞，加入胰酶消化后，加入含5%胎牛血清的MEM培养基悬浮细胞，按细胞悬液的5%加入病毒分离物，混匀后加入96孔细胞培养板，每孔100μl，同时设置阳性对照和阴性对照，于37℃CO2细胞培养箱中培养，每天观察细胞状态。当分离病毒组和阳性对照组出现细胞融合、变圆、拉网等病变现象时，弃去细胞培养液，PBST轻轻洗1次，每孔27 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析表3.1CDV全基因组扩增引物列表Table3.1PrimersusedinamplificationofCDVcompletegenome引物名称引物序列（5’-3’）目的片段大小（bp）ThenameofprmersPrimersequences(5’-3’)Purposefragmentsize(bp)ACCAGACAAAGTTGGCTAAGGATP1430ATGCTTGGGATTACCTCTACTAACTTGGGAGCAATAAGAGGGATAAAGP21449GGTCCCAGGTTGACTGAGCATGCTCAGCTAGTGTCAGAAATAGP3712TGATTCATCGAGATCCTGAGAATCCGACCACCCGTTCTATTCP41899TCCAACACCTAAAGGCAGCGAAATGACTGAGGTGTACGACTTCGP51440GCTTGCTACGTCCTGGACCCTAAAATTGTCTCGGTGTTGCTCCTGCAP6511TCGTCCTYGGGAGGTCYTGGTCTCGGACRTAGCAAGCCAACAGP72193CTACCTGAGCCCTAAGTTTTCACTTGAGAGGTTGGATGTAGGP8769ACCGTAACCCAATCTCATCTCTTAGGGCTCAGGTAGTCCAP91879CTAAGKCCAATTGARATGTGTTACAACCAGTGTTGAGAATTTAGTCP101242AGGAAAAGATCTCTCCTGTTATATGGCTCTAGACTTTGTTTTCATCACAGP111331GTTTGGTTATCACCTTGGACAAGTAGGATTGCATCACTTGTCCAAGGTP121144CCCACATGTGGTTCCTTAATGCTCCTAGAATAATAAACCGTTTGP131507TATCCTCATCACTTTCGCATATTTGGGACAGTGGGATGATTGP141842TTGGGATTGTCGTCAGGAATGTTCCATGCATACCCAGTTTP15424ACCAGACAAAGCTGGGTATGAT28 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析加入100μl4%多聚甲醛溶液，于4℃冰箱中过夜固定；PBST洗涤3次，每次5min。每孔加入100μl0.2%Triton于37℃通透10min，PBST洗涤3次，每次5min。每孔加入50μl5%的灭活羊血清于37℃封闭15min，将孔中的液体吸出。病变孔和阴性对照孔加入50μl稀释500倍的CDV-NP单克隆抗体，于37℃CO2细胞培养箱中孵育1h，PBST洗涤3次，每次5min，然后每孔加入50μl稀释500倍的FITC标记的山羊抗小鼠二抗溶液（含0.01%伊文思蓝），于37℃CO2细胞培养箱中孵育45min，PBST洗涤3次，每次5min，加入100μl1:2稀释的碱性甘油溶液，直接于荧光显微镜下观察。3.1.3.8动物回归试验选取CDV中和抗体小于1:2的健康易感的水貂和狐狸（CDV抗原和抗体都为阴性）各3只，分2组，第1组为水貂组，水貂滴鼻和点眼0.5ml，肌肉注射1ml；第2组为狐狸组，狐狸滴鼻和点眼0.5ml，肌肉注射1.5ml，2组在不同房间隔离饲养21d。每天观察动物的精神、食欲、眼部和鼻部症状，记录动物发病情况。当动物出现发病症状时，使用CDV抗原检测试纸条检测眼鼻分泌物。取动物的肺脏，使用RT-PCR和免疫组化对CDV进行检测。3.1.3.9CDVSD(14)7株的全基因组扩增与测序取SD(14)7株上清，按照QIAampViralRNAMiniKit提供的操作步骤提取病毒的RNA，使用全式金One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒合成cDNA。RT-PCR的反应体系为：5×FastPfuBuffer10μL，2.5mmol/LdNTP5μL，下游引物各2μL，FastPfuDNA聚合酶2μL，加无菌超纯水至50μL。反应条件：预变性95℃2min，变性95℃30s，退火50℃～59℃30s，延伸72℃1min～2min30s，35个循环后总延伸72℃5min，4℃10min。反应结束后，取5μLPCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用胶回收试剂盒纯化目的片段。将目的片段与pEASY-Blunt载体连接，转入DH5α感受态细胞，用蓝白斑法挑选白色菌落，经PCR鉴定为阳性后，至少选取3个阳性克隆送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。3.1.3.10CDVSD(14)7株的全基因组的拼接与序列分析各段测序结果去除载体序列后，使用DNAStar软件包中的SeqMan软件将各段序列进行拼接。用DNAStar软件找出SD(14)7株的全基因组序列中ORF的数目和位置，预测编码的蛋白质，然后上传GenBank。将SD(14)7株的全基因组序列与GenBank上登录的17株毒株的全基因组序列进行相似性分析，应用NetNGlyc1.0Server在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）分析H蛋白潜在的N-糖基化位点，使用MEGA5.0软件对SD(14)7株的全基因组和H基因和序列进行遗传进化分析。3.2结果3.2.1病毒的分离结果2014年7月于山东某狐狸养殖场采集的狐狸肺脏样品，在Vero-SLAM细胞上带毒盲传4代，出现细胞变圆、融合、拉网和脱落等明显的细胞病变，表明成功分离到1株病毒，命名为SD(14)7，如图3.1所示。29 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析图3.1A：SD(14)7接种Vero-SLAM细胞后产生的细胞病变；B：正常细胞Fig.3.1A:TheCPEofSD(14)7inVero-SLAMcell;B:Thenormalcell3.2.2病毒的RT-PCR鉴定结果使用CDV鉴定引物，经PCR扩增后得到大小约为668bp条带，与预期结果相符，如图3.2所示，证明为CDV阳性。图3.2RT-PCR鉴定结果M：DNA分子量标准Trans2K；1：SD(14)7；2：阳性对照；3：阴性对照Fig.3.2TheidentificationofRT-PCRM：DNAMarkerTrans2K;1:SD(14)7;2:Positivecontrol;3:Negativecontrol30 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析3.2.3病毒形态观察结果用分离到的病毒液上清作电镜负染观察，病毒粒子的外部有一层囊膜包裹，囊膜上含有纤突，具有副粘病毒粒子的形态特征，如图3.3所示。图3.3电镜下SD(14)7毒株粒子形态Fig3.3ThemorphologyofSD(14)7strainparticlewasobservedbytheelectronmicroscope3.2.4间接免疫荧光试验结果使用CDV-NPMab作为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠抗体为二抗，进行间接免疫荧光试验，分离病毒组和阳性对照组都可以看到绿色荧光，正常对照无荧光，如图3.4所示，证明SD(14)7株为CDV。图3.4间接免疫荧光鉴定A：SD(14)7间接免疫荧光鉴定结果；B：阳性对照；C：正常细胞Fig.3.4TheresultofindirectimmunofluorescenceA:TheindirectimmunofluorescenceresultofSD(14)7strain;B:Positivecontrol;3:Thenormalcell31 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析3.2.5动物回归试验结果3.2.5.1动物的发病症状使用SD(14)7株接种水貂和狐狸后，攻毒组水貂与狐狸于攻毒后7～10d出现眼睛和鼻子分泌物增多，并有明显的眼结膜炎和鼻炎，水貂于攻毒后14～15d全部死亡，狐狸于攻毒后10～12d全部死亡。剖检可以看到，动物肺脏出现卡他性炎症、出血，淋巴结出血、萎缩，肝脏肿大，脾脏肿大有坏死点，膀胱有出血点，小肠出血，具有CD的典型病理变化，如图3.5所示。使用CDV抗原检测试纸条检测眼鼻分泌物为CDV阳性。图3.5A：狐狸感染CDV的临床症状；B：水貂感染CDV的临床症状；C：狐狸肺脏病理特征；D：水貂肺脏病理特征Fig.3.5A:TheclinicalsignsofCDVinfectedfox;B:TheclinicalsignsofCDVinfectedmink;C:Thepathologicalfeaturesoflungoffox;D：Thepathologicalfeaturesoflungofmink3.2.5.2RT-PCR检测结果取死亡的水貂和狐狸的肺脏，经RT-PCR检测后可以看到，目的片段大小为668bp，与预期结果相同，证明动物的肺脏为CDV阳性，如图3.6所示。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析图3.6RT-PCR鉴定结果M：DNA分子量标准Trans2K；1～3：狐狸肺脏；4～6：水貂肺脏；7：阳性对照；8：阴性对照Fig.3.6TheidentificationofRT-PCRM：DNAMarkerTrans2K;1～3:thelungoffox;4～6:thelungofmink;7:Positivecontrol;8:Negativecontrol3.2.5.3免疫组化结果取水貂和狐狸的肺脏进行经免疫组化，肺泡壁上皮细胞中可以检测到CDV，图3.7。3.7狐狸和水貂的肺脏免疫组化结果；A：狐狸；B：水貂3.7Immunohistochemicalresultsoflungfromfoxandmink;A:fox;B:mink3.2.6SD(14)7株全基因组分段扩增结果应用15对引物分别进行RT-PCR扩增，扩增产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳，可见目的片段与预期相符，如图3.6所示。33 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析图3.6SD(14)7株全基因组扩增结果M：DNA分子量标准Trans2KPlus；1～16分别为：P5、P6、P7、P8、无阳性扩增、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P9、P1、P2、P3和P4Fig.3.6TheamplificationofSD(14)7straincompletegenomeM：DNAMarkerTrans2KPlus;1～16:P5、P6、P7、P8、Nopositiveamplification、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P9、P1、P2、P3andP43.2.7SD(14)7株全基因组拼接与分析结果经拼接得到SD(14)7株全基因组长度为15690nt，主要含有6个开放阅读框（ORF），分别为N、P、M、F、H和L基因，各基因长度分别为1683nt、1655nt、1447nt、2209nt、1946nt和6642nt，两端为5’UTR和3’UTR。3.2.8SD(14)7株与GenBank登录毒株之间的相似性分析结果将SD(14)7株与GenBank上登录的17株毒株的全基因组序列进行比对分析，比对结果如表3.2所示。SD(14)7株的全基因组、N、P、M、F、H和L基因与其他参考毒株对应基因的相似性分别为91.9%～98.8%、92.9%～99.3%、93.6%～99.0%、93.6%～99.2%、90.3%～98.1%、90.4%～98.9%和93.3%～99.1%。SD(14)7株全基因组序列与疫苗株CDV3、Onderstepoort和SnyderHill之间的相似性为91.9%～92.2%，与其他毒株的相似性为93.7%～98.9%，其中与HeBei株的相似性为98.1%，与LN(10)1株的相似性最高为98.8%。34 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析表3.2SD(14)7株与其他CDV毒株核苷酸序列的相似性Tabale3.2TheidentityofnucleotidesequencesofSD(14)7strainwithotherCDVstrains基因毒株全基因组N基因P基因M基因F基因H基因L基因198.198.798.298.997.697.898.4298.899.399.099.298.198.699.1397.898.398.699.095.598.997.6497.397.597.698.796.897.097.5597.197.197.798.696.596.997.6697.397.497.698.796.797.095.1794.295.794.996.592.092.195.2894.195.494.996.591.992.295.7995.196.295.996.393.594.995.71095.196.295.996.593.494.996.51195.897.296.497.893.994.895.91295.197.396.097.793.392.996.41395.697.595.997.793.594.494.71493.795.495.395.891.992.293.31592.192.993.694.190.590.793.41691.993.393.693.690.390.493.41792.293.193.894.990.390.498.3注：1～17：Hebei、LN(10)1、RD-JL、CDV-ZC、BJ-01、MKY-KM08、CYN07-dV、007Lm、55L、5804、5804P、A75/17、01-2689、164071、CDV2784/2013、CDV3、Onderstepoort和SnyderHill。3.2.9SD(14)7株全基因组的遗传进化分析使用MEGA5.0软件对SD(14)7株全基因组与GenBank上登录的其他毒株进行遗传进化分析，从进化树上可以看出，各毒株分别位于6个不同的基因型上，SD(14)7株属于Asia-1型，与CDV-JL株（KJ848781）和LN(10)1株（KP765764）遗传距离最近，与HeBei株（KC427278）遗传距离较远，如图3.7所示。35 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析71KJ848781/racoon_dog/JL/201468KP765764/fox/LN(10)1/Cnina/201074KP765763/fox/SD(14)7/China/201493KJ994343/raccoon_dog/ZC/China/2013Asia-1100KC427278/mink/Hebei/China/2008HM852904/Macaca_mulatta/MKY-KM08/China/2008AB687720/Macaca_fascicularis/CYN07-dV/Japan/2008100100100KF856711/monkey/BJ-01/China/2006100AY386315/5804EuropeAY386316/5804P45AY649446/raccoon_dog/01-2689/USA100AF164967/A75/17Amercia-2100EU716337/dog/164071/USA/2004KF914669/dog/2784/Italy/2013ArcticAB474397/dog/007Lm/Japan90Asia-2100AB475099/dog/55L/JapanAF014953/Onderstepoort100EU726268/CDV3America-1（Vaccines）100JN896987/Snyder_Hill0.01图3.7基于CDV全基因组序列的系统发育分析Fig.3.7phylogeneticanalysisofCDVcompletegenomesequences3.2.10SD(14)7株H基因的比对分析与系统发育分析将SD(14)7株与近年来中国流行的CDV野毒株SD(13)5（KF880682）、HLJ(08)4（FJ423607）、HeB(09)1（HM448830）、CDV-ZC（KJ994343）、LN(10)1（KP765764）、CDV-RD-JL（KJ848781）、NJ(12)7（KJ489383）、SY（KJ466106）、LN(13)2（KF880677）、HLJ(13)1（KF767692）、HeB(13)1（KF006820）和SD(12)1（JX844220）的H基因序列进行比对，比对结果显示，SD(14)7与SD(12)1和SD(13)5的相似性最高，分别为99.5%和99.6%，表3.2。将SD(14)7株H基因序列与GenBank上登录的Asia-1、Asia-2、America-1（Vaccine）、America-2、Artic、Europe、Europewild-life基因型的毒株进行系统发育分析，可见SD(14)7株位于Asia-1型，与SD(13)1株和SD(13)5株遗传距离较近，与HeBei株遗传关系较远，如图3.8所示。36 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析94KF880678/raccoondog/SD(13)1/China/201390KF880682/mink/SD(13)5/China/201366KP765763/fox/SD(14)7/China/2014JX844220/mink/SD(12)1/China/2012100KC494688/mink/SD(12)3/China/2012KF880677/mink/LN(13)2/China/20137796KJ994343/raccoondog/ZC/China/2013KJ848781/racoondog/JL/20146172KP765764/fox/LN(10)1/Cnina/2010FJ423607/dog/HLJ(08)4/China/20097HM448830/raccoondog/HeB(09)1/China/200982Asia-197KF006819/raccoondog/LN(13)1/201394KF006820/mink/HeB(13)1/2013100AB475098/dog/Th12/ThailandAB753775/dog/Ac96I/JapanJN896331/dog/PS/China/2010KJ489383/dog/NJ(12)7/China/2012HQ540292/dog/HLJ2-07/China/20078664JX681125/fox/HLJ1-06/China/200691KC427278/mink/Hebei/China/200855KF767692/fox/HLJ(13)1/China/201384KJ466106/raccoondog/SY/China/2012100AY386315/5804AY386316/5804P100KM280689/dog/Uy251/Uruguay/2012Europe68EU098103/dog/BR2/Brazil100EU098104/dog/BR3/Brazil90DQ889189/dog/H06Ny13/HungaryZ47759/mink/DK86/DenmarkEuropewilde-lifeX84999/ferret/1493/GermanKF640687/dog/R252/USA59AY649446/raccoondog/01-2689/USAKF430374/mink/7606338/Denmark/200466AF164967/A75/17America-26781EU716337/dog/164071/USA/200498KJ123771/dog/171391-513/USA/2004AB474397/dog/007Lm/JapanAB476402/dog/50Con/Japan100AB476401/dog/011C/JapanAsia-210096AB475099/dog/55L/Japan66AB475101/dog/009L/JapanZ47760/dog/GR88/GreenlandEF445052/fox/HL/China100KM115535/dog/BA376/Italy/2013Arctic10099DQ226087/dog/179/94/ItalyDQ889186/dog/H06Bp10S/Hungary100AF378705/OnderstepoortZ35493/Convac100AY466011/raccoondog/98-2654America-1(Vaccine)97EU726268/CDV381JN896987/SnyderHill0.01图3.8基于CDVH基因序列的系统发育分析Fig.3.8PhylogeneticanalysisofCDVHgene37 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析3.2.11SD(14)7株H氨基酸序列分析将SD(14)7株与从GenBank上调取的其他Asia-1型CDV毒株的H基因的推导氨基酸序列进行对比，可见SD(14)7株H蛋白发生I542N，Y549H的突变，如图3.9所示。542位～544位变为NRT，成为1个潜在的N-糖基化位点，与SD(12)1、SD(12)3、ZC、SD(13)5和LN(13)2毒株相似，潜在的N-糖基化位点数目都为10个，而其他毒株潜在的N-糖基化位点数目都为9个。图3.9SD(14)7株与其他CDV毒株H基因的氨基酸序列比对Fig.3.9alignmentoftheHaminoacidsequencesofSD(14)7andotherCDVstains3.3讨论3.3.1病毒的分离CDV属于副粘病毒科，外层包有囊膜，易受外界环境的影响，而使病毒囊膜破裂，失去侵染细胞的能力，因此病毒分离过程中病料的选择、病料的运输、病料的处理、细胞的培养等方面都可能影响病毒的分离效果。本研究从1只CD阳性狐狸肺脏成功分离到了1株CDV，命名为SD(14)7，该毒株的成功分离可能与以下原因有关：（1）病料的选择：一般选取CD症状明显的动物，采集脾脏、肺胀、淋巴结等组织用于病毒分离。我们曾尝试使用动物全血进行病毒分离，但是处理后的血样接入细胞，培养24h后细胞死亡，可能是由于血样中含有一些物质可以导致细胞死亡，从而不适于病毒分离。（2）病料的处理：本研究使用液氮对病料进行研磨，研磨液上清中加入了2000单位双抗，用于抑制组织中细菌的生长，与相关文献报道的方法相同（张文奎等，2012；王秀东等，2010），取得了较好的分离效果。（3）细胞的选择：本研究使用了Vero-SLAM细胞，SLAM作为CDV的细胞受体，使病毒与细胞的亲和能力增强，从而增加了病毒成功分离的几率（Lanetal.,2005;Lanetal.,2006）。38 中国农业科学院硕士学位论文第三章犬瘟热病毒SD(14)7株分离鉴定及全基因组测序与分析3.3.2病毒的毒力通过动物回归试验可以看出，攻毒组全部出现眼睛和鼻分泌物增多，大部分动物出现肠炎症状，这些症状为临床上CD的重要特征（王聪等，2013；王胜乐等，2012），从动物的发病和死亡情况可见该毒株具有很强的致死性，与之前研究结果不同（王君玮，2008），表明近年来暴发的CDV可能发生了变异，导致CDV的毒力和传染性增强。从发病动物的组织脏器变化来看，发病动物伴有细菌感染，导致动物的死亡。由于CDV感染后可以破坏宿主的免疫细胞和免疫器官，从而使机体对CDV的免疫防御和清除能力降低，容易造成机会感染，多种细菌、病毒可以攻击宿主，对宿主的健康和生命照成威胁，所以在CDV感染后要防止细菌和病毒等的继发感染（Beinekeetal.,2009），从而降低动物的死亡率。3.3.3SD(14)7株全基因组与H基因分析从SD(14)7株全基因组与从GenBank上调取的其他毒株相比，与JL株的相似性最高为98.8%，与疫苗株CDV3、Onderstepoort和SnyderHill之间的相似性较低为91.9%～92.2%，表明SD(14)7株发生了较大的变异，这可能与疫苗的免疫失败有关。SD(14)7株各基因中，F和H基因与其他毒株的相似性较低，表明F和H基因变异较大。SD(14)7株与近年来中国流行的其他CDV毒株的H基因序列相比，SD(14)7与SD(12)1和SD(13)5的相似性最高，分别为99.5%和99.6%，表明SD(14)7仍为山东地区当前流行的野毒株。从SD(14)7株全基因组与H基因分析中可以看出，SD(14)7株属于Asia-1型，并且其H基因发生了变异，即I542N和Y549H，与中国流行的其他Asia-1型毒株相比多了1个潜在的N-糖基化位点，与中国近年来出现的新的流行变异株相同（朱春生等，2014；Zhaoetal.,2014），可见SD(14)7株为当前流行的突变株。H蛋白起着与细胞受体结合的作用，其549位位于H蛋白与SLAM受体V区结合区域内。近年来，在许多地区感染CDV的动物体内检测到CDV毒株H蛋白出现了Y549H的突变（Sekulinetal.,2011;Zhaoetal.,2014;Techangamsuwanetal.,2014），Y549H的变异可能会使CDV对非犬源动物的适应性增加，并导致发病动物死亡（McCarthyetal.,2007;Nikolinetal.,2012）。H蛋白潜在的N-糖基化位点的增加可能会使CDV的毒力增强（Sawatskyetal.,2010），研究表明近年来中国山东等地区毛皮动物中发生CD，可能与该变异株的流行有关（Zhaoetal.,2014）。SD(14)7变异野毒株的成功分离鉴定，有助于对当前毛皮动物中流行CDV基因变异的研究，为阐明CDV的发病机制和针对于中国流行CDV毒株疫苗的研制打下了基础。39 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究摘要：为了阐明SD(14)7株对水貂、狐狸和貉的致病力，该研究使用SD(14)7株细胞毒攻击CDV抗体阴性的水貂、狐狸和貉。结果表明，狐狸对该毒株最敏感，水貂感染后也出现明显症状，但耐受时间较长，貉感染后症状不明显，但是耐受时间较短。从动物的发病症状和组织病理变化来看，症状以眼鼻分泌物增多为主，剖检可见淋巴结出血或肿大、脾脏肿大有坏死点、肺脏炎症出血等，表明该毒株主要感染淋巴组织和器官。组织切片和免疫组化结果表明，貉组织器官病变最严重，其次为水貂，狐狸较轻。貉的脑中可以观察到包涵体，并且3种动物的脑中均可检测到CDV，证明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。动物的体温变化无明显的“双相热”特征，于攻毒后3～7d和6～9d开始分别通过粪便和眼鼻分泌物向外界排毒，CDV在淋巴结中含量最高。本研究证明，SD(14)7株对淋巴结和淋巴组织的侵染能力最强，具有一定的神经嗜性，能够造成动物继发感染而死亡。该毒株致病力的阐明，有利于CDV发病机制和发病过程的研究。关键词：犬瘟热病毒；水貂；狐狸；貉；致病性近年来由于养殖密度过大、各地区之间频繁引种及CDV基因变异，导致中国毛皮动物养殖区CD频发，并呈地方性流行，给中国的毛皮动物养殖业造成巨大的损失。为明确中国主要毛皮动物养殖区当前流行的毒株特性，本研究使用分离到的SD(14)7株攻击水貂、狐狸和貉子，对动物体温变化、排毒情况、病毒在各组织脏器中的分布以及淋巴细胞数目和白细胞数目的改变等进行了研究，从而明确SD(14)7株的致病性，为当前CD的有效防治提供理论依据。4.1材料和方法4.1.1试验动物和毒株试验用水貂、狐狸和貉由中国农业科学院特产研究所毛皮动物实验基地提供。Vero-SLAM细胞、SD(14)7株和疫苗株CDV3由中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室保存。4.1.2主要试剂和仪器TM病毒RNA/DNA小量提取试剂盒、PrimixExTaq(ProbeqPCR)，购自TaKaRa；TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；荧光定量PCR仪，购自Thermo；正置显微镜，购自Nikon；组织研磨仪，购自Thmorgan；离心机，购自日本三洋。4.1.3病毒TCID50测定5将Vero-SLAM细胞传代培养，制备细胞悬液，并调整细胞浓度为6.18×10个细胞/ml,取稀释好的细胞悬液加入96孔细胞板中，每孔100μL。以无血清MEM培养基对SD(14)7株毒液进行-1-810倍系列稀释，并将10～108个稀释度分别接种到含Vero-SLAM细胞的96孔细胞板中，每孔100μL，设8个重复。把细胞培养板放入37℃CO2培养箱中，每天观察细胞的状态，待细胞40 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究出现病变后，记录细胞病变孔的数目，按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。4.1.4阴性动物的筛选采集水貂、狐狸和貉的血液，待析出血清后，5000rpm4℃离心10min，取上清放入新的1.5mL离心管，再8000rpm4℃离心10min，取上清备用。使用RT-PCR检测CDV抗原，同时将血清按2倍系列稀释后，取各稀释度血清稀释液分别与等量犬瘟热病毒疫苗株CDV3病毒液（滴度为200TCID50/100μL）混匀，37℃孵育1h。取混合液分别接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，做8个重复，补加Vero细胞悬液，每孔100μL，同时设有阳性对照和阴性对照。于37℃CO2培养箱中培养中培养5d，每天观察细胞的病变情况，按照Reed-Muench方法计算血清中和抗体效价。选出CDV抗原阴性和中和抗体效价<1:2的动物作为阴性动物，用于后续试验。4.1.5动物的分组与攻毒水貂、狐狸和貉各挑选5只健康的阴性易感动物，分为两组，第1组为攻毒组包括水貂、狐狸和貉各3只；第2组为正常对照组包括水貂、狐狸和貉各2只。将SD(14)7株Vero-SLAM细胞培养物按1：5稀释，攻毒组水貂、狐狸和貉各肌肉注射2ml，对照组按攻毒组的剂量和方法接种正常Vero-SLAM细胞培养液。攻毒组与对照组分别在不同的区域饲养，两组之间没有任何交叉。4.1.6动物的致病性研究自攻毒后第0d开始，每天观察动物的状态，包括食欲、饮欲、精神状态、眼部和鼻子症状变化等，每天采集攻毒组和对照组动物的眼鼻和直肠拭子，放入灭菌的1.5mL离心管中，于-20℃冰箱中保存待用，并测量体温。于攻毒后0d、3d、7d、10d和14d，使用荧光定量PCR法测定血液中CDV的含量。待动物死亡后，对死亡动物进行剖检，观察并记录各脏器的病变特征。采集动物的肺脏、肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肠、肾以及膀胱等组织器官，取部分组织放入装有10%甲醛溶液的50mL离心管中进行固定，剩余组织留样，用于病毒在动物组织内的分布研究。4.1.7动物组织的病理切片与免疫组化待组织固定完全后，制备成石蜡切片，之后进行HE染色和免疫组化实验。4.1.8病毒RNA的提取和cDNA的合成每个装有眼鼻和直肠拭子的1.5mL离心管中分别加入500μLDEPC水，搅拌拭子使拭子上的物质充分溶于DEPC水，取200μL用于RNA的提取。每份组织脏器，使用电子天平称取0.5g，放入5mL离心管中，加入2mLDEPC水，并放入2颗无菌钢珠，于组织研磨仪上1100rpm震荡2min，不易粉碎的样品可以重复震荡几次，直至研磨完全为止。然后，将研磨后的组织反复冻融三次，8000rpm4℃离心10min，取200μL上清用于RNA的提取。RNA提取采用TaKaRa病毒RNA/DNA提取试剂盒，最终使用30μLddH2O洗脱RNA。cDNA的合成采用TransScript41 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒。反应体系为：2×TsReactionMix10μL，EnzymeMix1μL，gDNARemover1μL，随机引物1μL，RNA7μL。反应条件为：42℃1.5h，85℃5min。cDNA合成后，于-80℃保存，用于下游实验。4.1.9荧光定量PCR测定病毒含量使用荧光定量PCR方法中的TaqMan探针法，测定动物排毒期和病毒在动物各组织中的分布。TaqMan探针法所用的PCR引物、探针序列和反应条件参照Elia等（2006）的方法。反应体系为：PrimixExTaq(ProbeqPCR)10μL，CDV-F和CDV-R各0.4μL，CDV-Pb0.2μL，cDNA模板3μL，加无菌超纯水至20μL。反应条件为：预变性95℃30s，变性95℃15s，退火48℃1min，延伸60℃1min，40个循环后40℃10s。于每个循环的延伸阶段收集信号。本方法为绝对定量法，阳性质粒为连接pMD18-T载体的CDV-NP基因，长度约为4500bp。每批实验之前，需绘制标准曲线。4.2结果4.2.1病毒TCID50测定结果-3.596孔板经3d出现细胞病变，经计算得出SD(14)7第1代毒的TCID50值为10/1ml。4.2.2动物的发病特征攻毒组水貂，NO.20攻毒后第7d死亡，无CD症状；攻毒后第10d，NO.19和NO.21食欲下降，精神不振，出现结膜炎，眼部分泌物增多；攻毒后第11dNO.19排出脓便，其他症状与前几天相同，攻毒后第12dNO.19和NO.21食欲废绝；攻毒后第13dNO.21出现肠炎症状；攻毒后第14dNO.21便血；攻毒后第15dNO.19和NO.21死亡。水貂发病特征如图4.1所示图4.1貉和水貂感染后的临床特征A和B：貉和水貂眼部分泌物增多Fig.4.1theclinicalsymptomsofraccoondogandminkafterinfection;AandB:Secretionsfromtheeyesofraccoondogandmink42 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究攻毒组貉，攻毒后第7d食欲减退，NO.23出现神经症状；攻毒后第9dNO.23死亡，并保持牙齿咬住笼子的姿势；攻毒后第10dNO.22脚垫增厚；攻毒后第11dNO.22食欲减退、脱水、结膜炎，NO.24出现结膜炎；攻毒后第12dNO.22精神不振，食欲废绝，于晚上死亡；攻毒后第14d，NO.24便血；攻毒后第15dNO.24死亡。貉发病特征如图4.1所示。攻毒组狐狸攻毒后第8d食欲减退，攻毒后第9dNO.13出现结膜炎，眼部分泌物增多；攻毒后第10dNO.13脚趾干裂出血，NO.15出现结膜炎，眼部分泌物增多；攻毒后第11d饮欲增强，其他症状与前几天相同；攻毒后第12dNO.13死亡，NO.14鼻镜干裂出血，NO.15食欲废绝，NO.14于晚上死亡；攻毒后第13d，NO.15死亡。狐狸的发病特征如图4.2所示。图4.2攻毒后狐狸的发病特征A：NO.13脚趾干裂出血；B：NO.14结膜炎和鼻镜干裂出血；C：NO.15结膜炎，眼部分泌物增多Fig.4.2theclinicalsymptomsoffoxsafterinfectionA：NO.13toesbleeding;B:NO.14conjunctivitisandnosebleeding;C:NO.15conjunctivitisandsecretionsfromtheeyes对照组水貂、狐狸和貉，食欲、饮欲正常，没有不良反应出现。4.2.3发病动物的组织脏器病变特征攻毒组水貂，肺出现卡他性肺炎、出血，脾上有坏死点，肠出血、肠系膜淋巴结出血，膀胱有出血点等。攻毒组貉，肺出现卡他性肺炎，膀胱出血，肠出血、肠系膜淋巴结出血或肿大，脑轻微出血，脾肿大等，部分病变图片如图4.3所示。攻毒组狐狸，肺出现卡他性炎症、轻微出血，脾肿大、有坏死点，肠系膜淋巴结出血，脑膜出血，膀胱出血，肠出血，部分病变图片如图4.4所示对照组水貂、貉和狐狸器官正常，无病变特征。43 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.3貉和水貂感染后的组织病变特征A：NO.23貉肺脏溃疡出血；B：NO.22貉肺脏溃疡出血；C：NO.22貉肠系膜淋巴结肿大出血；D：NO.19水貂肺脏出血坏死；E：NO.24貉肠系膜淋巴结出血；F：NO.24貉膀胱出血；G：NO.22貉肠出血；H：NO.19水貂脾脏肿大Fig.4.3Tissuelesioncharacteristicsofraccoondogandminkpostinfection;A：NO.23raccoondogulcerandbleedingofthelung；B:NO.22raccoondogulcerandbleedofthelung;C:NO.22raccoondogenlargementandbleedingofmesentericlymphnode;D:NO.19minkhemorrhagenecrosisoflung;E:NO.24mesentericlymphnodebleeding;F:NO.24raccoondoghemorrhageofbladder;G:NO.22raccoondogintestinalbleeding;H：NO.19minkspleenenlargement44 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.4狐狸感染后的组织病变特征：A：NO.15狐狸肺溃疡出血；B：NO.15狐狸膀胱出血；C：NO.13狐狸肠系膜淋巴结出血Fig.4.4ThetissuelesioncharacteristicsafterinfectionoffoxA:NO.15foxulcerandbleedingofthelung;B:NO.15foxhemorrhageofbladder;C:NO.13foxbleedingofmesentericlymphnode4.2.4动物组织的病理切片和免疫组化结果从攻毒组狐狸、貉子和水貂的组织切片和免疫组化结果可以看出，狐狸、水貂和貉子的肺脏肺泡间隔增大、破裂、淤血，肺泡壁上皮细胞和支气管上皮细胞含有CDV；大脑胶质细胞增生，神经细胞空泡化，经免疫组化实验可以在貉子的脑内检测到CDV，而狐狸和水貂脑内没有检测到CDV；膀胱黏膜上皮细胞脱落，于水貂的膀胱上皮细胞中可以观察到CDV；脾脏的生发中心破坏，淋巴细胞减少，白髓萎缩，于淋巴小结周围的淋巴细胞和巨噬细胞中可以检测到CDV；淋巴结中淋巴细胞明显减少，淋巴小结结构消失，3种动物的淋巴细胞中都可以检测到CDV。狐狸、水貂和貉子的组织切片和免疫组化结果如图4.5-4.7所示。貉子的组织病变最严重，其次为水貂，狐狸病变较轻。45 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.5狐狸各脏器组织切片和免疫组化结果：A:肺脏轻度淤血；B:CDV位于肺泡壁上皮细胞和支气管上皮细胞中；C：脾脏淋巴细胞明显减少，白髓萎缩；D：CDV位于淋巴小结周围的淋巴细胞和巨噬细胞中；E：淋巴结中淋巴细胞明显减少，淋巴小结结构消失，巨噬细胞增生；F：CDV抗原出现在巨噬细胞中；G：膀胱部分黏膜上皮细胞脱落；H：大脑胶质细胞增生、神经细胞空泡化Fig.4.5:Thetissuesectionandimmunohistochemicalofdifferentorgansoffox:mildcongestion(A)andCDVantigeninthesyncytialpneumocytesandinthebronchialmucosalepithelium(B)wereseeninthelung.Lymphocytopeniaandwhitepulpatrophy(C)andCDVantigeninthemacrophagocyte(D)wereseeninthespleen.Lymphocytopenia,structureoflymphoidnoduledisappearedandmacrophageinfiltration(E)andCDVantigeninthemacrophagocyte(F)inthelymphaden.Desquamationofepithelialcells(G)wasseeninthebladder.spongiocyteproliferationandneurocytevacuolization(H)wereseeninthecerebrum46 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.6水貂各脏器组织切片和免疫组化结果：A：广泛性的肺泡壁毛细血管淤血；B：CDV抗原存在于肺支气管粘膜上皮细胞中；C：脾巨细胞明显增生（骨髓外造血）；D：CDV存在于巨噬细胞中；E：膀胱移行上皮细胞内的胞浆包涵体；F：CDV抗原存在于上皮细胞中；G：淋巴结中淋巴细胞明显减少，小结结构消失；H：大脑-轻度的胶质细胞增生，部分神经细胞空泡化Fig.4.6Thetissuesectionandimmunohistochemicalofdifferentorgansofmink:A:Extensivecongestion（A）andCDVantigenintheBronchialmucosalepitheliuminthelung(B).Macrophageproliferation(C)andCDVantigeninthemacrophagocyte(D)wereseeninthespleen.Intracytoplasmicinclusionbodies(E)andCDVantigenintheepithelialcells(F)wereseeninthebladder.Lymphocytopeniaandstructureoflymphoidnoduledisappeared(G)inthelymphaden.Mildspongiocyteproliferationandneurocytevacuolization(H)wereseeninthecerebrum47 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.7貉各脏器组织切片和免疫组化：A：肺泡壁毛细血管淤血，肺泡腔内积聚浆液性渗出物；B：CDV抗原出现在支气管粘膜上皮细胞中；C：脾中红细胞蓄积增多，淋巴细胞明显减少，白髓萎缩，白髓内巨噬细胞增生；D：CDV抗原出现在脾脏淋巴细胞中；E：大脑神经细胞的核内包涵体；F：CDV抗原出现神经细胞中；G：淋巴结中淋巴细胞明显减少，固有结构消失；H：膀胱粘膜下层小血管淤血，黏膜上皮细胞（移行上皮细胞）脱落Fig.4.7Thetissuesectionandimmunohistochemicalofdifferentorgansofraccoondog:A:Congestionandserouseffusionintheintra-alveolar(A)andCDVantigeninthebronchialmucosalepitheliumwereseeninthelung(B).Erythrocytosisandlymphocytopenia,whitepulpatrophiedandmacrophageinfiltration(C)andCDVantigeninthelymphocyte(D)wereseeninthespleen.Intracytoplasmicinclusionbodies(E)andCDVantigenintheneuron(F)inthecerebrum.Lymphocytopeniaandinherentstructuredisappeared(G)wereseeninthelymphaden.Congestionanddesquamationofepithelialcells(H)wereseeninthebladder.48 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究4.2.5动物的体温特征取攻毒组每只动物的体温与对照组动物的体温平均值进行分析，可以看出水貂于攻毒后第5d体温升高，5～8d一直维持较高的体温，第9d体温降低，第10d以后体温又有所升高，死亡前1d体温骤降到35℃以下，对照组水貂的体温在正常范围内波动（图4.8）。攻毒组狐狸除NO.22于攻毒后第5d上升以外，NO.23和NO.24无明显升高趋势。从攻毒后第6d开始，3只狐狸体温开始升高，于死亡之前体温降低，NO.22和NO.24体温骤降到35℃以下，对照组狐狸的体温在正常范围内波动（图4.9）。攻毒组貉NO.15于攻毒后第0～3d体温降低，NO.13和NO.14体温升高；攻毒后第4d3只狐狸体温都升高，攻毒后第5d则降低，之后NO.13和NO.14一直维持在较高体温，直到死亡之前体温骤降；NO.15于攻毒后第8d体温又升高，直到死亡之前，体温还维持在较高温度，对照组貉的体温在正常范围内波动（图4.10）。图4.8水貂体温变化Fig.4.8Temperaturechangeofminks图4.9狐狸体温变化Fig.4.9Temperaturechangeoffoxes49 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究图4.10貉体温变化Fig.4.10Temperaturechangeofraccoondogs4.2.6动物的抗体效价采集攻毒后第0、3、7、10和14d水貂、狐狸和貉的血清，进行中和实验，测定动物的抗体效价，结果表明，除NO.23貉于攻毒后第7d产生少量抗体，其余血清按1:10稀释检测不到抗体，如表4.1所示。4.1攻毒组动物的抗体效价Tabal4.1Antibodytiterofthechallengegroup攻毒后天数（d）动物编号Dayspost-infection(d）AnimalsNumber0371014NO.13————×狐狸NO.14—————FoxNO.15————NO.19—————水貂MinkNO.21—————NO.22————×貉NO.23——1:7.9××RaccoondogNO.24—————注：—：中和抗体效价<1:4；×：死亡Note：—:Neutralizingantibodytiterlowerthan1:4;×:Death50 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究4.2.7动物的排毒期经荧光定量PCR检测后可以看出，狐狸、水貂、貉分别于攻毒后第6～8d、8d、8～9d开始可以从眼鼻拭子中检测到CDV（表4.2），分别于攻毒后第3～7d、6～7d、5～7d开始可以从直肠拭子中检测到CDV（表4.3），直到动物死亡一直有病毒排出。对照组从第0d开始到第21d都没有检测到CDV。表4.2攻毒组眼鼻拭子中CDV检测结果Tabal4.2DetectionofCDVineyesandnoseswabsfromchallengegroup攻毒后天数（d）动物编号Dayspost-infection(d）AnimalsNumber0-56789101112131415NO.13-++++++×狐狸NO.14--+++++×FoxNO.15---+++++×水貂NO.19---+++++++×MinkNO.21---+++++++×貉NO.22---++++×RaccoonNO.23----+/×dogNO.24---+++++++×注：-：CDV阴性；+：CDV阳性；×：死亡Note:-:CDVnegative;+:CDVpositive;×:Death表4.3攻毒组直肠拭子中CDV检测结果Tabal4.3DetectionofCDVinractalswabsfromchallengegroup攻毒后天数（d）动物编号Dayspost-infection(d）AnimalsNumber0-23456789101112131415NO.13---+++++++×狐狸NO.14-+---+++++×FoxNO.15-----++++++×水貂NO.19----+++++++++×MinkNO.21-----++++++++×NO.22---+++++++×貉NO.23-----+++/×RaccoondogNO.24-----++++++++×注：-：CDV阴性；+：CDV阳性；×：死亡Note:-:CDVnegative;+:CDVpositive;×:Death51 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究4.2.8CDV在血液内的含量经荧光定量PCR检测后可以看出，3种动物于攻毒后第3d即可在血液中检测到CDV，NO.19和NO.21水貂于攻毒后第14dCDV含量降低，NO.22和NO.24貉分别于攻毒后第10d和14dCDV含量降低，如表4.4所示。表4.4攻毒组动物血液中CDV的含量（copies/μL）Tabal4.4ThelevelsofCDVinthebloodoftheanimalsfromthechanllengegroup(copies/μL)攻毒后天数（d）动物编号Dayspost-infection(d）AnimalsNumber0371014355NO.1301.17×102.63×106.46×10狐狸355NO.1404.07×101.00×107.76×10Fox255NO.1508.32×102.24×104.90×103554NO.1902.40×101.41×101.94×101.38×10水貂MinkNO.2104.57×1038.91×1059.77×1051.45×105255NO.2202.45×103.02×102.19×10貉34NO.2304.68×104.27×10Raccoondog3554NO.2403.09×103.98×103.72×101.20×104.2.9CDV在各组织内的分布经荧光定量PCR检测后可以看出，攻毒动物淋巴结中病毒含量最高，肺、脾和肠其次，脑中含量最低。如表4.5所示。表4.5水貂、狐狸和貉各组织脏器中CDV含量的平均值Taba4.5TheaveragelevelsofCDVintheorganizationsvisceraofminks、foxesandraccoondogs组织内病毒含量（copies/μL）动物ThelevelofCDVintheorganizations(copies/μL)Animals肺肝脾肾淋巴结膀胱肠脑Lungliverspleenkidneylymphglandbladderintestinecerebrum水貂545375626.51×104.98×102.46×101.27×101.65×101.06×101.35×103.13×10Mink狐狸545363535.92×102.52×106.60×102.73×103.55×104.45×107.95×101.13×10Fox貉656575651.65×105.26×101.99×101.25×101.19×104.03×102.51×102.51×10Raccoondog52 中国农业科学院硕士学位论文第四章犬瘟热病毒SD(14)7株的致病性研究4.3讨论4.3.1动物的致病性从动物的发病情况来看，狐狸对SD(14)7株最敏感，其次是貉，水貂虽然发病非常明显，但是耐受时间较长。从攻毒后第7d开始，攻毒动物逐渐出现发病症状，并于发病后1w左右死亡。眼鼻分泌物增多为动物的主要发病特征，与之前研究结果相同（闫如勋，2011；高晗等，2010），发病症状严重者会出现鼻镜干裂出血、脚趾肿大出血以及神经症状等特征。从动物的组织病变可以看出，各组织出血情况较严重，这可能与CDV感染宿主后，导致宿主淋巴细胞损伤，机体的免疫系统被破坏，造成动物的机会感染，最终使宿主组织损伤严重而死亡。从病理切片和免疫组化结果表明，貉子组织器官病变最严重，其次为水貂，狐狸较轻，这可能与动物感染CDV后受病原微生物继发感染的程度有关。貉子的脑中可以观察到包涵体，证明SD(14)7株具有侵袭神经细胞的能力，这也与NO.23貉子出现神经症状相符。水貂和狐狸的脑也出现病变，但是免疫组化没有检测到CDV，可能是由于切片部位的不同或操作方法不当所致。4.3.2动物的体温从攻毒后动物的体温变化来看，没有明显的“双相热”特征，与之前研究结果相同（闫如勋，2011），但会有体温升高。与对照组相比，攻毒组动物体温相对较高，这与动物感染CDV后机体出现炎症反应有关。4.3.3动物的排毒期与病毒在组织内的分部从荧光定量检测的结果来看，发病动物从攻毒后6～9d开始可以在眼鼻拭子中检测到CDV，从攻毒后3～7d开始可以在直肠拭子中检测到CDV，并且在整个发病过程中都有病毒排出，表明此时CDV在动物的眼、鼻和肠上皮细胞中增殖，并且向外界环境排放病毒。然而，狐狸、水貂和貉于攻毒后第9～11d才出现眼睛、鼻分泌物增多，可见感染CDV动物在出现明显的发病症状之前，已经向外界排毒，此时即可通过气溶胶感染其他动物，因此在动物出现不良反应时，应尽早对动物进行CDV检测，如果证明动物为CDV阳性，应立即使用CDV高免血清进行治疗或进行捕杀，防止疫情扩散。从病毒在各组织内的分布情况来看，攻毒动物淋巴结中病毒含量最高，肺、脾和肠其次，脑中含量最低，表明SD(14)7株对淋巴细胞的感染能力最强，其他组织中存在CDV，可能是通过血液循环将病毒运送至靶器官；脑中检测到CDV，可能是由于CDV经过血脑屏障进入脑组织中，表明该毒株具有一定的神经嗜性。53 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论第五章全文结论1.分析了Fsp、H和F基因测序，证明当前中国主要毛皮动物区内流行的CDV野毒株仍为Asia-1型，部分地区出现H蛋白I542N和Y549H的变异株，并且该变异株增加了1个潜在的N-糖基化位点，F基因的Fsp基因序列变异率很高，可能与当前犬瘟热的流行有关。2.使用Vero-SLAM细胞从疑似犬瘟热狐狸的肺脏中分离得到1株病毒，经RT-PCR、电镜观察、间接免疫荧光、动物回归试验等证明为CDV野毒株。3.测定了SD(14)7的全基因组测序，证明该毒株为当前中国主要毛皮动物养殖区内流行的CDV变异株。4.研究了SD(14)7株的致病力，表明该毒株对水貂、狐狸和貉都具有感染和致死性，其中对貉的致病性最强，并具有神经嗜性，为探讨当前CD的发病过程和发病机制奠定了基础。54 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中国农业科学院硕士学位论文附录附录1实验所用仪器汇总仪器名称厂家型号生物安全柜苏州安泰空气技术有限公司，型号：BSC-1300IIA2超净工作台苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-1FPCR仪Biometra公司，型号：070-851核酸电泳仪北京六一仪器厂，型号：DYY-8C小型离心机Sigma公司，型号：1-14ED凝胶成像系统GE公司，型号：ImageQuant300恒温水浴锅上海景宏实验设备有限公司，型号：DK-8D水平摇床北京市六一仪器厂，型号：WD-9405B-80℃超低温冰箱中科美菱低温科技有限责任公司，型号：DW-HL388高压蒸汽灭菌器HIRAYAMA公司，型号：HVE-50紫外分光光度计Eppendorf公司，型号：6131-24861低温离心机HITACHI公司，型号：CF16RXII纯水仪Rephile公司，型号：RD0E06000电子天平上海精密科学仪器有限公司，型号：YP202N分析天平METTLERTOLEDO，型号：ME303E62 中国农业科学院硕士学位论文附录附录2实验所需溶液的配方1.0.01mol/LPBS缓冲液（pH7.4）：称量8gNaCl，0.2gKCl，2.89gNa2HPO4•12H2O，0.2gKH2PO4，溶于800mL去离子水中，调pH7.4，定容1L，121℃高压灭菌30min，室温保存。2.8g/L生理盐水：称量0.8gNaCl，溶解于100mL去离子水中，121℃高压灭菌30min，室温保存。3.24mg/mLIPTG：称1.2gIPTG置离心管中，加入40mL去离子水，充分溶解，定容至50mL，0.22µm滤膜过滤除菌，分装后，-20℃保存。4.20mg/mLX-Gal储液：称1.0gX-Gal置离心管中，加入40mL二甲基甲酰胺(DMF)，充分溶解，定容至50mL，分装后，-20℃避光保存。5.氨苄青霉素储存液（100mg/mL）：称量5g氨苄青霉素，加4mL去离子水，充分溶解，定容至5mL，0.22µm滤膜过滤除菌，分装后，-20℃保存。6.卡那霉素储存液（50mg/mL）：称取卡那霉素2g于50mL离心管中，加入40mL去离子水，充分溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后，-20℃保存。7.50×TAE电泳缓冲液：称量242gTrisbase，18.6gNa2EDTA•2H20,加入800mL去离子水溶解，再加入57.1mL冰乙酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L，室温保存，使用时稀释为1×工作液。8.LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，加800mL去离子水溶解后，用NaOH调节pH到7.0，去离子水定容到1L，116℃高压蒸汽灭菌后4℃保存。9.含有氨苄青霉素的LB固体培养基：在LB液体培养基配方中加入15g琼脂，充分溶解后，121℃高压灭菌30min，待培养基冷却至45℃左右，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，倒平板，封口，4℃贮存。63 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢丰富多彩的硕士生活即将结束，回首硕士三年，伴随着苦读、钻研、迷茫、思索、顿悟的历程，我收获了知识和人生阅历。本论文在闫喜军研究员的悉心指导下完成的。三年来，闫老师在学术上的倾心指导，生活上的殷切关怀，人生道路上的谆谆教诲都令学生受益终身，他以渊博的学术知识、勤奋严谨的治学态度、极富远见的学术眼光以及无私高尚的奉献精神深深地影响着我，引领我在科研的道路上奋勇向前。在此论文完成之际，请允许我向我的恩师致以最诚挚的谢意！感谢赵建军老师对试验设计及执行中给予的指导和诸多帮助，使我受益良多。还要感谢张蕾老师、张海玲老师、胡博老师、白雪老师、邵西群老师、刘昊老师、史宁老师、鲁荣光老师、吕爽老师、薛向红老师在试验过程中给予的鼓励和热情帮助；感谢徐淑娟老师在试验过程中提供的便利条件。感谢苗利光主任、刘晓颖老师、朱言株老师、李海涛老师对我试验的帮助。感谢闫如勋师兄、倪佳师姐、朱春生师兄、王振军师兄、王洋师弟、马凡舒师妹、范思宁师妹、凌明玉师妹以及特产所12级所有硕士同学在试验、学习和生活中给予的关心和帮助，他们与我分享了许多实验经验，陪伴我走过三年难忘而美好的时光。感谢孙见师兄在病料采集过程中给予的帮助，为试验的顺利进行奠定了基础。感谢中国农业科学院特产研究所的领导以及科研处的各位老师给予的培养和关怀。感谢中国农业科学院研究生院的许多老师给予的帮助。感谢我的父母和家人，是你们长久以来的鼓励和支持，让我勇敢自信的面对挫折、战胜困难。你们无私的爱和鼓励激励着我不断前进！最后，衷心祝愿中国农业科学院特产研究所蓬勃发展，越来越好！64 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历孙彦刚，男，汉族，1989年9月生，河南省安阳市内黄县人。2012年毕业于吉林农业科技学院动物科学学院，制药工程专业，获得工学学士。2012年9月考入中国农业科学院特产研究所，攻读兽医硕士学位。导师为闫喜军研究员，研究方向为动物传染病及其病原分子流行病学。硕士期间主要关于犬瘟热病毒流行病学调查、病毒的分离鉴定以及蛋白表达相关研究。发表文章：孙彦刚,赵建军,闫喜军.水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析[J].中国畜牧兽医,2015,42(4):838-846.65
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