鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析

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1、硕士学位（毕业）论文鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析学位申请人：崔元指导教师：孙继国教授袁万哲教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200403鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析IsolationandIdentificationofDuckParvovirusSDStrainandAnalysisofGenomicCharacteristics学位申请人：崔元指导教师：孙继国教授袁万哲教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期

2、：二〇一八年六月一日摘要“鸭短喙-侏儒综合征”（Beakatrophyanddwarfismsyndrome,BADS）是一种以雏鸭发育不良、喙萎缩变形、舌外伸肿胀和骨质疏松为主要特征的传染病。自2014年11月以来，该病在我国东南多省的商品肉鸭群中发生并流行，给我国鸭养殖业造成了严重的经济损失。本研究旨在从流行病学与病原学角度出发，分离相关病原进行致病性分析，明确引发BADS的病因，并建立病原实验室检测方法，探究致病病原的相关特性，为该病的防控提供理论依据及技术支持。本文主要从以下三个方面进行论述：首先，为了探究BADS的致病原因，本研究对发生BADS病鸭的肝脏和脾脏进行了PCR/RT-PC

3、R检测，排除了其他的鸭常见疫病，将该病的病原命名为鸭细小病毒（Duckparvovirus,DPV）。将阳性病料研磨液接种鸭胚，盲传5代，收获尿囊液，通过PCR检测、测序鉴定、同源进化分析、动物回归试验，最终确定本研究成功分离到了一株DPV（命名为DPVSD）。此外，本研究还利用鸭胚成纤维细胞（Duckembryofibroblasts,DEF）对病毒进行了分离培养，PCR和间接免疫荧光试验（Indirectimmunofluorescenceassay,IFA）结果表明，本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。DPVSD株的成功分离为DPV的进一步研究打下了基础。其次，为了进一步探究DPV分子水

4、平上的特性，本研究对SD株的全基因组序列进行了分段扩增，并对其基因序列进行了结构特征分析及同源进化分析。结果表明，SD株全长5053bp，由两端的末端倒置重复序列（Invertedterminalrepeat,ITR）和中间的开放阅读框（Openreadingframe,ORF）组成。左侧ORF（LORF）编码非结构蛋白NS，右侧ORF（RORF）编码结构蛋白VP。SD株与其他BADS分离株和鹅细小病毒（Gooseparvovirus,GPV）欧洲分离株的亲缘关系较近，而与番鸭细小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）分离株的关系较远。此外，与绝大多数水禽细小病毒相比，S

5、D株的ITR区分别于100~114nt和337~350nt的区域存在14个碱基的缺失。最后，潜在糖基化位点的预测分析结果表明，SD株NS和VP蛋白上共有6个潜在糖基化位点。本研究为DPV的分子致病机制及分子流行病学调查的深入研究奠定了基础。最后，本研究通过PCR扩增了SD株的VP3基因，构建了标准品重组质粒pMD19-SD-VP3。选取VP3基因中在各株DPV之间较为保守且和其他水禽细小病毒有差异的区域，设计了1对荧光定量PCR引物及1条荧光探针。经过对反应体系的优化和标准曲线的绘制，最终建立了针对DPV的荧光定量PCR检测方法，并对其特异性、灵敏性和可重复性进行了验证。结果表明，建立的DPV

6、Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、可重复性良好。此检测方法的建立为DPV的实验室诊断提供了有力的技术支持。关键词：鸭细小病毒；分离鉴定；全基因组测序；荧光定量PCRIsolationandIdentificationofDuckParvovirusSDStrainandAnalysisofGenomicCharacteristicsAuthor:CuiYuanMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAdvisors:Prof.SunJiguo;Prof.YuanWanzheAbstractBeakatrophyanddwarfismsynd

7、rome(BADS)wasaninfectiousdiseasecharacterizedbystronggrowthretardation,beakatrophy,protrudingtonguewithswellingandosteoporosis.SinceNovember2014,thediseasehasbeenprevalentincommercialduckfarmsinmanyso