鸭瘟病毒sdwf株的分离鉴定及致病性研究

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1、山东农业大学硕士学位论文鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定及致病性研究姓名：张坤申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：刁有祥20120615山东农业人学顾lj学位论文中文摘要鸭瘟(DuckPlague，DP)，是由鸭瘟病毒(Duckplaguevirus，DPV)弓I起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性接触性传染病，其特征是流行广泛、传播迅速、发病率和死亡率高，严重成肋、养鸭业的发展。鸭瘟于1923年由Baudet首次在荷兰报道，之后在许多国家均有流行。1957年黄引贤在我国广州报道了本病。至今，全国各养

2、鸭地区均有本病流行的报道，为了更有效的防治DPV，有必要发展简单、快速的检测方法和良好的病原检测及定位手段，并对其致病机理进行深入研究。本研究内容包括四部分：一、鸭瘟病毒SDWF株的分离鉴定通过鸭胚尿囊膜接种，从疑似鸭瘟病例中分离到l株病毒，采用血清中和试验、动物回归试验和PCR方法对分离毒株进行了鉴定，并对毒株的生物学特性进行了研究。致病性试验结果表明，分离毒株人工感染SPF鸭的症状及剖检变化与自然感染病例相同；分离株无血凝活性；鸭胚半数致死量ELD50为lO‘4‘33／0．2mL；对氯仿、乙醚敏感

3、：不耐酸碱、不耐热。分离毒株PCR鉴定结果显示，PCR产物与预期大小一致，其产物序列与鸭瘟病毒标准强毒株相应片段核苷酸的同源性为99．9％。上述结果表明，分离毒株为DPV，且为强毒株，命名为SDWF株。二、鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用为建立一种简便、快速、灵敏、特异的DPV检测方法，本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列，设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)弓f物，经优化反应体系，建立了LAMP快速检测方法。结果表明，LAMP方法能够在63℃恒温下，1h内

4、实现目的核酸的大量扩增。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreenI染料，就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法敏感性可达0．245pg／gL，比普通PCR灵敏性高10倍；对I型鸭肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭新城疫病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应；利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的j；日性检出率为30％。该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法。三、鸭瘟病毒强毒株感染SPF鸭动态病理组织学研究将纯化的DPV人工感染2月龄SPF鸭

5、，定期剖杀试验组和对照组鸭，对各组织器官的病理组织学变化进行观察，并进行血常规和血液生化指标检测。结果显示：人工I鸣瘟4『b毒的分高攀定技致柏。件研究感染后24h，感染SPF鸭中枢免疫器官胸腺、法氏囊淋巴细胞数量减少，组织间隙增大；肝脏、脾脏组织病变较为严重，其余组织器官均出现程度较轻的病理变化。感染后48"-'96h，中枢免疫器官的淋巴细胞极度减少，网状细胞增生，组织器官结构模糊不清，严重充血、出血；其余组织器官出现细胞变性、出血等病理变化。感染后120h，组织细胞变性、坏死，出现大片坏死区。点眼滴

6、鼻组SPF鸭感染DPV后组织学变化与皮下注射组相似，只是发生的时fHJ推后约24"--48h。对照组SPF鸭病理组织学观察未见损伤。WBC、HGB、AST、ALT等发z￡显著变化。该结果表明，接种DPV强毒感染SPF鸭的组织器官严重受损，特别是免疫器官，甚至会引起免疫抑制。四、间接免疫荧光染色(IFA)检测鸭瘟病毒及在鸭体内的抗原定位将纯化的DPV免疫清洁级新西兰白兔，高免血清经辛酸．硫酸铵法和葡聚糖G200柱纯化，制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，通过反应条件的优化，建立了DP

7、V间接免疫荧光(IFA)快速珍断方法。试验结果表明：一抗的最佳稀释度为1：100，感作时间为4℃过夜；二抗的最佳工作浓度为1：200，感作时间为37℃1h，DPV特异性黄绿色荧光最清晰。以IFA对DPV人工感染鸭的各组织器官进行检测，在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、泄殖腔、肠道、肾脏、肺脏及气管中均检测到DPV抗原，以肝脏、脾脏等组织中荧光最强。表明这些器官是DPV感染后的主要靶器官。关键词：鸭瘟病毒(DPV)；分离鉴定；环介导等温扩增技术(LAMP)；SPF鸭；病理组织学变化：间接免疫荧光

8、染色(IFA)山东农业人学顺{j学位论义Isolation，identificationandstudyonpathogenicityofduckplaguevirusSDWFstrainAbstractDuckplague(DP)isanacutesepticinfectiousdiseasethatcausedbyduckplaguevirus(DPV)jandcharacterizedbyitshighprevalence，morbidityand